血氧红素酶-1（HO-1），又称热休克蛋白32，是血红素分解的起始酶和限速酶，具有抑制各种细胞凋亡、抗炎及抗氧化应激[1-3]等重要生物学作用。本研究应用HO-1特异性抑制剂锌原卟啉（ZnPP）联合顺铂（CDDP）干预人肝癌HepG2细胞，探讨ZnPP抑制HO-1表达对肝癌细胞CDDP化疗敏感性的影响及其可能的机制。南京医科大学第一附属医院普外科·肝胆中心孔连宝

一、材料与方法

1.材料：CDDP和ZnPP购自sigma公司；HO-1和内参照β-actin引物由invitrogen合成；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Biouniquer公司；RT-PCR试剂盒购自Toyobo公司；HO-1单克隆抗体购自北京博奥森公司。

2.细胞培养：采用人肝癌HepG2细胞株为实验对象，进行常规培养。

3. MTT法检测细胞生长抑制率：以每孔6×103个细胞接种于96孔板，细胞贴壁后加药。ZnPP终浓度为1、10、20、50和100μmol/L；CDDP终浓度为1、2.5、5、10和20μg/ml；联合用药组先加ZnPP（终浓度20μmol/L）1h后再加上述CDDP各浓度。另设不加药物的对照组，每个剂量设七个复孔。48h或72h后加MTT（5mg/ml）20μl/孔，孵育4h后弃去上清，每孔加DMSO 150μl，于490nm波长测定A值,计算细胞生长抑制率。

抑制率(%)=（1-实验组A 值/对照组A 值）×100%

4.流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率：以每孔1.2×105个细胞接种于六孔板内，设不加药对照组、ZnPP(20μmol/L)组、CDDP（5μg/ml）组和联合用药组(ZnPP 20μmol/L+CDDP5μg/ml）。加药培养48h后收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作。

5. RT-PCR检测细胞HO-1mRNA表达：实验分组同上，加药培养24h后提取总RNA，取等量RNA逆转录为cDNA。HO-1上游引物5′-GCTCTTTGAGGAGTTGCAGG-3′,下游引物5′-GTGTAAGGACCCATCGGAGA-3′,产物长度196bp；β-actin上游引物5′-TTGCGTTACACCCTTTC TT-3′,下游引物5′-TGT CACCTTCACCGTTCC-3′，产物长度150bp。基因扩增的反应条件：95℃预变性10min；94℃1min ,59℃40s ,72℃1min ,循环27次,72℃延伸10min。产物在1.5%的琼脂糖上电泳,利用Syngene系统进行图像分析。

6.Western blot检测细胞HO-1蛋白表达：实验分组同上,加药24h后收集细胞提取蛋白，通过Western blot分析HO-1蛋白表达变化。将结果扫描入计算机分析吸光度。

7.细胞内活性氧检测：实验分组同上,加药后继续培养24 h，胰酶消化离心收集细胞，按活性氧检测试剂盒说明书操作。

8.统计学方法：所有实验数据以均值±标准差（x(-)±s）表示,应用方差分析进行样本间的两两比较，P <0.05有统计学意义。

二.结果

1.各组细胞抑制率比较：不同浓度的CDDP均能抑制HepG2细胞增殖，具有剂量依赖性,随着浓度增加抑制率得到增强。ZnPP（20μmol/L）联合不同浓度CDDP，对肝癌细胞抑制率均明显高于单用药组（P <0.05）。

2.各组细胞凋亡率比较：单用ZnPP（20μmol/L）或DDP(5μg/ml)48h后, 细胞凋亡率均较对照组升高，分别为9.61%和25.35%( 对照组：1.79%)；联合用药后细胞凋亡率显著升高,达51.46%,与单用药组比较差异有统计学意义(P <0.05)。

3.各组细胞中HO-1mRNA表达变化：对照组中可见HO-1mRNA表达，应用ZnPP后细胞中HO-1mRNA表达降低；而应用化疗药物CDDP后，HO-1mRNA表达明显升高，联合应用ZnPPIX可逆转此现象，提示外源性应用HO-1特异性抑制剂ZnPPIX能够抑制HO-1mRNA表达。

4.各组细胞中HO-1蛋白表达变化： HO-1蛋白表达变化与其mRNA表达一致。

5.各组细胞内活性氧变化：对照组细胞内活性氧水平较低，应用ZnPP或CDDP后活性氧升高，与对照组比较分别增加了0.51±0.05和0.59±0.04倍；联合用药后能活性氧显著提高，较对照组提高了2.37±0.19倍，与单用药组比较有统计学意义（P <0.01）。

三 讨论

本实验结果显示ZnPP对HepG2细胞生长抑制作用呈剂量依赖性，同时细胞中HO-1mRNA和蛋白表达下调，细胞内活性氧产生增加，提示ZnPP抑制HepG2细胞生长活性可能与降低细胞HO-1表达，增加细胞内活性氧产生有关。应用化疗药物CDDP后，细胞内HO-1表达增高，联合应用ZnPP抑制细胞HO-1表达后，细胞内活性氧和细胞凋亡率较单用药组显著增加，表明ZnPP能够通过阻断细胞内HO-1表达增加细胞化疗敏感性，其机制肯能与增加细胞内活性氧有关，与在其他肿瘤细胞[5]中报道一致。但Hill M[6]等在乳腺癌细胞中也发现，人为降低HO-1表达能促进肿瘤生长，提高HO-1表达则降低肿瘤生长。HO-1在不同肿瘤细胞中作用不同，可能与组织细胞特异性有关，具体机制还有待于进一步研究。总之，合理调控肿瘤中HO-1表达有望为肝癌治疗提供一个新的思路。

参考文献：

[1] 陈晓波，李永翔，董维平等.血红素氧合酶-1基因转染对大鼠胰岛培养的影响.中华实验外科杂志,2007,24:415-416

[2] 刘胜春,姚榛祥,孙正魁.锌原卟啉对种植性乳腺癌细胞凋亡的影响.中华实验外科杂志,2006,23:525-527

[3] 陈洪元,张黎,程力,等.短发夹RNA沉默血红素氧合酶-1基因表达对胃癌细胞系SGC-7901生物学行为的影响.中华实验外科杂志,2009,26:199-201

[4] Mayerhofer M,Gleixner KV,Mayerhofer J, et al. Targeting of heat shock protein 32 (Hsp32)/heme oxygenase-1 (HO-1) in leukemic cells in chronic myeloid leukemia: a novel approach to overcome resistance against imatinib.Blood,2008, 111:2200-2210

[5]  Hill M,Pereira V,Chauveau C,et al. Heme oxygenase-1 inhibits rat and human breast cancer cell proliferation: mutual cross inhibition with indoleamine 2,3-dioxygenase. FASEB J, 2005, 19:1957–1968.