商冠宁1，2 吕刚2 孙平1 邢浩1 郑珂1 王玉名1 王巍1

1， 辽宁省肿瘤医院骨软组织肿瘤科，辽宁 沈阳 110042辽宁省肿瘤医院(中国医科大学肿瘤医院)骨软组织肿瘤科商冠宁

2， 中国医科大学附属一院骨科，辽宁 沈阳 110003

【摘要】

目的：研究探讨OPN在骨肉瘤组织中的表达情况，分析其与骨肉瘤侵袭、转移的关系。 方法：免疫组化S-P法检测OPN在60例骨肉瘤及20例骨软骨瘤中的表达。结果：OPN在骨肉瘤中表达阳性率为76.7% ，在骨软骨瘤中为22.2% ，二者间有显著性差异。OPN与骨肉瘤临床病理特征的分析结果提示，OPN的表达与患者性别、年龄、病理分型无关，与临床分期和肺转移显著相关。随着临床分期程度的增高，肺转移的发生，OPN表达呈增高趋势，组间有显著性差异。结论：

OPN可能是判断骨肉瘤恶性程度及预后的指标，提示可作为骨肉瘤转移的治疗标靶。OPN可成为预测肿瘤预后的指标，用于监测肿瘤复发转移。

【关键词】 骨肉瘤；OPN；转移；抗体；化疗敏感性

 

骨肉瘤是青少年时期最常见的原发骨恶性肿瘤，随着新辅助化疗和保肢手术的开展，骨肉瘤的生存率得到明显提高。但骨肉瘤的转移问题仍然是影响其疗效的主要原因，一旦发生转移则预后较差。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注，已被广泛公认为是肿瘤转移相关基因或转移基因[1] [2]。本研究运用免疫组化S-P法检测骨肉瘤组织中OPN的表达，分析OPN表达与骨肉瘤临床病理特征之间的关系探讨OPN与骨肉瘤生物学行为的相关性及在肿瘤侵袭转移的作用。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  标本来源

免疫组化实验标本为1997年3月至2006年5月期间辽宁省肿瘤医院有完整临床随访资料的骨肉瘤石蜡标本60例, 对照组为骨软骨瘤石蜡标本20例。骨肉瘤病例取材前未经化疗，其中男性40例，女性20例；年龄11-53岁，中位年龄19.3岁。组织学分型采用WHO骨肿瘤分类标准分类：骨母细胞型25 例，软骨母细胞型17 例，纤维母细胞型18例。临床分期参照Enneking分期法：Ⅱa期11例，Ⅱb期37，Ⅲ期12例。

1.1.2  主要试剂

兔抗人OPN多克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、加强型DAB试剂盒、PBS缓冲液及枸橼酸盐缓冲液均购自福建迈新生物技术开发公司。

1.2 实验方法

应用免疫组化S-P法，实验步骤如下：石蜡切片经60℃烤片1h后，二甲苯常规脱蜡15分钟，梯度酒精水化，酒精浓度分别为95%、80%、70%。每个梯度5分钟。然后用PBS冲洗三次，每次5分钟。用自来水冲洗切片3分钟至清洁透明，然后将其置于蒸馏水中待用。将切片置于注入了1000mlPH为6.0的柠檬酸缓冲液的专用切片盒中，再将盒放入高压锅中中，加盖后加热10-15分钟（抗原修复）。将切片盒取出，置于室温中冷却。PBS冲洗三次，每次5分钟。滴加3%H2O2（试剂A）室温下孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗三次，每次5分钟。除去PBS液，每张切片滴加50ul封闭用正常山羊血清工作液试剂（试剂B），室温下孵育10分钟。除去血清，每张切片滴加50ul的第一抗体抗体，（OPN抗体1：50），4℃过夜。PBS冲洗三次，每次5分钟。除去PBS液，每张滴加50ul生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10分钟。PBS冲洗三次，每次10分钟。除去PBS液，每张切片滴加50ul链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶（试剂C），室温孵育10分钟。PBS冲洗三次，每次3分钟。除去PBS液，每张切片滴加100ul新鲜配制的DAB溶液（1：100），出现背景色时在显微镜下观察，如出现阳性征则立即用自来水冲洗。苏木素复染45秒～2分钟，自来水冲洗返蓝。切片经梯度酒精脱水，溶液分别为70%、80%、95%，每个梯度5分钟，二甲苯透明5分钟。待干燥后，中性树胶封固。显微镜阅片、照相。

免疫组化结果判断标准参照Ozdemir等的评分标准，以已知阳性的胃癌切片作为阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。

1.3统计学方法

所有数据统计均在SPSS 16.0统计软件包中完成，分别采用χ2检验方法进行。P<0.05有统计学意义。

2  结果

2.1  OPN在骨肉瘤及骨软骨瘤中的表达情况

OPN在骨肉瘤中的表达部位均在骨肉瘤细胞浆及细胞膜，染成棕色及棕褐色颗粒为阳性，多呈弥漫状分布，偶见呈灶性分布。未染成棕色为阴性。骨软骨瘤中亦可见OPN呈细胞浆及细胞膜表达。OPN在骨肉瘤中表达阳性率为76.7% ，并且多表达为阳性及强阳性，在骨软骨瘤中为22.2% ，二者相比差异有显著意义（表1）。

表1，骨肉瘤及骨软骨瘤中OPN的表达

其中χ2=19.51，P=0.00001。

2.2  OPN表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

骨肉瘤组织中OPN表达与临床病理特征的分析结果提示，OPN的表达水平仅与临床分期和肺转移显著相关，而与患者性别、年龄、肿瘤体积、病理分型等临床病理因素无关。随着骨肉瘤临床分期程度的增高，肺转移的发生，OPN染色呈逐渐增强趋势，组间比较差异有统计学意义 （表2）。

表2，骨肉瘤OPN表达与临床病理资料的相关性

类别

例数

OPN阳性表达

χ2

P值

例数

百分率（%）

性别

 

 

 

 

 

男

40

31

77.5

0.05

0.82

女

20

15

75.0

 

 

年龄

 

 

 

 

 

<18岁

33

26

78.8

0.18

0.66

>18岁

27

20

74.1

 

 

部位

 

 

 

 

 

膝关节

46

37

80.4

1.56

0.21

膝关节以外

14

9

64.3

 

 

体积

 

 

 

 

 

<100cm3

23

18

78.3

0.05

0.82

>100cm3

37

28

75.7

 

 

ALP

 

 

 

 

 

<500u/l

24

18

75.0

0.46

0.495

>500u/l

36

28

77.8

 

 

病理分型

 

 

 

 

 

骨母细胞型

25

21

84.0

1.76

0.415

软骨母细胞型

17

13

76.5

 

 

纤维母细胞型

18

12

66.7

 

 

临床分期

 

 

 

 

 

ⅡA期

11

5

45.5

7.9

0.02

ⅡB期

37

30

81.1

 

 

Ⅲ期

12

11

91.7

 

 

肺转移

 

 

 

 

 

无

38

26

68.4

3.94

0.047

有

22

20

90.9

 

 

 

3  讨论

   

骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，远处转移早，预后较差，5年生存率低。近年来，随着以新辅助化疗为主的综合治疗在骨肉瘤治疗中的开展，患者生存率得到明显提高，但仍然有近1/3的患者因为肿瘤对化学治疗和放疗等传统治疗方法敏感性低，在术后2～3年死于肺转移[3]。对于骨肉瘤转移机制的深入研究以及探讨治疗骨肉瘤转移的新方法，已经成为改善骨肉瘤预后的根本所在。

OPN是一种的磷酸化蛋白质，在人体组织中广泛分布，且具有多种功能[4]。OPN分子中心有一个特殊的RGD序列（Arg-Gly-Asp），是多种整合素和CD44的配体，起着细胞粘附蛋白和细胞因子的作用。OPN不仅在组织发育过程中，而且与许多疾病，如肿瘤、炎症、免疫反应、血管重建等有关。Senger[5]于1979年首先报道OPN与肿瘤之间的关系以来，其与肿瘤的关系日益引起人们的关注，已被广泛公认为是肿瘤转移相关基因或转移基因。已发现在肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌等[6] [7] [8] [9]多种肿瘤组织中表达增高，而且发现在很多肿瘤中OPN的表达增高与肿瘤的复发转移有关[10] [11]。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，人们已经认识到细胞癌变主要是由于遗传信息发生改变所致，致癌基因的激活表达，抑癌基因的丢失或功能丧失，导致了细胞癌变，而肿瘤转移基因与转移抑制基因的异常表达是肿瘤远处转移的一个重要原因。针对肿瘤转移基因OPN及其受体的干预，可能成为防治肿瘤转移的潜在靶点。同时，OPN也可能是肿瘤远处转移和预后的预测分子。目前，关于OPN的研究大多集中在上皮源性恶性肿瘤中。而有关OPN在骨肉瘤组织中表达的相关实验研究尚未见报道。

本研究应用免疫组化方法研究OPN在骨肉瘤组织与良性骨软骨瘤组织中的表达，结果提示OPN在骨肉瘤中高表达，并且多表达为阳性及强阳性，与良性骨肿瘤骨软骨瘤比较，两者间有显著性差异。结果证实OPN与骨肉瘤的恶性转化以及肿瘤的侵袭转移过程等恶性生物学行为相关。另外，在临床病理资料的分析中，发现OPN表达与临床分期有关，骨肉瘤临床分期越晚，OPN的表达水平越高，提示OPN的表达程度与病期进展相一致。骨肉瘤中OPN的表达可作为评估预后指标的结果，预示OPN高表达时肿瘤有较高的侵袭性和提示不良预后。

骨肉瘤的临床分期主要是由原发瘤的大小、区域淋巴结状况以及远处转移的情况所决定的，对于骨肉瘤的治疗方案的决定、预后评价十分重要。新辅助化疗对于骨肉瘤的疗效不可替代的地位已经确立。本研究抽取的60例病人中，有23例未坚持系统化疗，约占全部病例的38.3%。在随访与病例分析中发现，新辅助化疗的毒副作用及经济原因是骨肉瘤患者不能坚持完成规范治疗的主要原因之一。由于新辅助化疗副作用个体化差异的存在，少数患者因明显副作用而被迫停止治疗，且由于化疗疗程长，依从性不好的患者亦可能中断治疗；有些患者则因自身文化水平的限制，对疾病和治疗的认识不够充分，也可能中断治疗。坚持完成骨肉瘤综合治疗是提高骨肉瘤患者生存率的有效方法之一，由此加强对骨肉瘤知识的宣传和教育普及必将有助于骨肉瘤综合治疗的完成，而个体化治疗以及生物靶向治疗的出现和发展将提高现有治疗手段的有效性，减轻副作用。

综上所述，本研究的免疫组化结果提示，骨肉瘤组织中OPN呈高表达，明显高于正常骨组织及骨软骨瘤组织，提示OPN可能在骨肉瘤侵袭转移的恶性转化过程中，促进了骨肉瘤的发生和发展。骨肉瘤远处转移组中OPN阳性表达率高于无转移组，这提示在骨肉瘤的浸润和转移过程中，OPN可能发挥了不可低估的作用。目前骨肉瘤转移诊断仍依赖于影像学检查，明确诊断时多已出现明显症状，疗效较差，检测骨肉瘤组织中OPN表达水平可能预测骨肉瘤转移，为实现骨肉瘤转移的早期诊断提供一种新的思路。同时，也提示我们应进一步前瞻性研究OPN在侵袭、转移发生发展中的作用及确切的分子机制，从而为临床解决骨肉瘤远处转移的发生提供有效的干预手段。

【参考文献】

1.      Weber GF. The metastasis gene osteopontin :a candldate target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta. 2001; 1552 (2): 61-85.

2.      Ritting SR, Chambers AF. Role of osteopontin in tumor progression. Br J cancer. 2004; 90(10):1877-1881.

3.      Whelan JS. Osteosarcoma. Eur J Cancer. 1997;33(10):1611-1618.

4.      Liaw L, Birk DE, Ballas CB, et al. Altered wound healing in mice lacking a functional osteopontin gene(spp1). J Clin Invest. 1998; 101(7):1468-1478.

5.      Senger DR, Wirth DF, Hynes RO. Transformed mammalian cells secrete specific proteins and phosphoproteins. Cell. 1979; 16(4):885-893.

6.      Zhang J, Takahashi K, Takahashi F, et al. Differential osteopontin expression in lung cancer. Cancer Lett. 2001; 171(2):215-222.

7.      Irby RB, Mccarthy SM, Yeatman TJ. Osteopontin regulates multiple functions contributing to human colon cancer development and progression. Clin Exp Metastasis. 2004; 21(6): 515-523.

8.      Zhou Y, Dai DL, Martinka M, et al. Osteopontin expression correlates with melanoma invasion .J Invest Dermatol. 2005; 124(5):1044-1052.

9.      Boldrini L, Donati V, Dell,Omodarme M, et al. Prognostic significance of osteopontin expression in early-stage non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 2005; 93(4):453-457.

10.    Kao CL, Chiou SH, Ho DMT, et al. Elevation of plasma and cerebrospinal fluid osteopontin levels in patients with atypical teratoid/rhabdoid tumor. Am J Clin Pathol. 2005; 123(2): 297-304.

11.    Wong TS, Kwong DL, Sham J, et al. Elevation of plasma osteopontin level in patients with undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. Eur J Surg Oncol. 2005; 31（5）：555-558.