短期营养不良对雌性小白鼠生殖能力的影响
2018年08月23日 【健康号】 王怀秀     阅读 5517

王怀秀[1] 李弘 袁彩霞  秦琴

                   (山西省人民医院不孕不育科,太原030012 )北京家圆医院生殖中心王怀秀

 

【摘要】 目的:研究短期营养不良对雌性小白鼠生殖能力的影响。方法:将40只10周龄雌性小白鼠随机均分为研究组及对照组。研究组取卵前36小时仅供给饮水;对照组正常饮食。采用体外受精的方法,观察两组小鼠的获卵数,卵母细胞成熟度及卵裂率,取卵前检测两组小鼠卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)以及雌二醇(E2)水平。结果:研究组雌鼠平均获卵数2.80+1.24,对照组雌鼠平均获卵数 4.00+1.17(p=0.0032);卵母细胞第一极体排出率及卵裂率研究组分别为12.5%、14.3%,对照组分别为88.8%、70.4%( P<0.00001)。 FSH、LH 及E2研究组分别为1.32+0.49  mIU/ml、2.08+0.39mIU/ml及3.56+0.46pg/ml,对照组分别为4.45+0.72 mIU/ml、15.72+2.38mIU/ml及 36.53+1.90pg/ml(p<0.0001)。两组所有观察指标均具有极显著差异。结论:短期营养不良可明显降低小白鼠获卵数及卵子成熟度,减弱卵母细胞的体外受精能力。

【关键词】小白鼠;营养不良;卵母细胞;体外受精    

中图分类号:Q132.1+2

The correlation of short period starvation to fecundity in female mice

                  Wang Huaixiu,liHong,Yuan Caixia ,Qin Qin

(Department of infertility,Shanxi Provincial Hospital, Taiyuan ,03012)    

【Abstract】Objective: To analyse the influence of  malnutrition for short period on fecundity of female  mice. Method: Before ovum pick-up,40 female  mice were randomized into study group (starved for 36 hours) and control group (normal diet). The number,maturity and the cleavage rate  of oocytes retrieved from study group were compared with those from control group.Before ovum pick-up, follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH) and estrodiol (E2) of both groups were assayed. Results: The number of oocytes retrieved (mean+ SD) were 2.80+1.24 in study group and 4.00+1.17 in control group (p=0.0032).The release rate of first polar body and cleavage rate of oocytes were 12.5% and 14.3% respectively in study group and 88.8% and 70.4% respectively in control group (p<0.00001). FSH, LH and E2 were 1.32+0.49 mIU/ml, 2.08+0.39 mIU/ml, 3.56+0.46 pg/ml respectively in study group and 4.45+0.72 mIU/ml, 15.72+2.38 mIU/ml, 36.53+1.90 pg/ml respectively in control group (p<0.0001)。All parameters  were significantly different. Conclusion: In mice, malnutrition for short period could significantly reduce the  number of oocytes retrieved and adversely affect the maturity and the cleavage rate of oocytes .

【Key words】 mouse;malnutrition;oocytes;in vitro fertilization

自1978年第一例体外受精的婴儿(试管婴儿)诞生以来,不孕症的治疗取得了突破性进展。但是由于体外受精的结局受多种因素的影响,其成功率一直较低。因此,研究影响其成功率的因素,成为生殖医学面临的重要课题。本实验中,我们对小白鼠短期营养不良与其排卵数、卵子成熟度、卵裂率以及性激

素进行了相关性分析,以了解营养不良对生殖功能的影响。

 

                    材料与方法

一、材料

1 试剂

尿促性腺激素 、人绒毛膜促性腺激素购自丽珠制药厂。透明质酸酶、 矿物油 、胎牛血清购自美国Sigma公司。ART1020受精培养液、ART1026卵裂培养液及含Hepes缓冲剂的培养基ART1023购自美国Sage公司。

2、实验动物

40只10周龄昆明品系雌性小白鼠,10只 10周龄昆明品系雄性小白鼠由山西省中医药研究院实验动物房提供。

二、方法

1、实验分组及饲养条件

   将40只雌鼠随机均分为研究组和对照组。研究组取卵前36小时仅供给饮水;对照组正常饮食。10只雄鼠正常饮食。所有动物均在山西省人民医院实验动物房饲养,饲养室温度18-22℃,自然光线照明。

2 精子制备

    颈椎脱臼法处死雄鼠,无菌条件下从附睾尾部采取精液,置0.5ml ART1020培养液中在5% CO2,37℃培养箱孵育。30 min后,在倒置显微镜下观察精子分散情况,用血球计数板计数精子密度。用ART1020液将精子密度调整为5X106/ml,取0.1ml移入0.4ml获能液中(ART1020+10%胎牛血清),使获能液中精子密度成为1X106/ml。含精子获能液上复矿物油,置5%CO2、37℃培养箱中获能。

3、促排卵及体外受精

每只雌鼠腹腔注射尿促性素15IU刺激卵泡发育,48小时后腹腔注射绒促性素10 IU 促进排卵。注射hCG后16小时, 行心脏采血送检FSH、LH及E2。取血后,以颈椎脱臼法处死雌鼠,取出输卵管置于ART1023培养液中, 在体视显微镜下用针头将膨大的输卵管壶腹部刺破, 用巴斯德吸管将卵子-放射冠-卵丘细胞复合物移入含透明质酸酶( 150 IU/ml) 的ART1023培养液中。 5min后,在体视显微镜下计数脱掉放射冠及颗粒细胞的卵子数。用剥卵针将卵母细胞移入ART1023培养液滴中洗涤两次, 转移到含1×106/ml活动小鼠精子的获能液中体外受精。5小时后,倒置显微镜下观察释放第一极体卵母细胞数,将已释放第一极体的卵子移入ART1026+20%小牛血清培养液中继续培养。20小时后,倒置显微镜下观察发育到2细胞阶段的胚胎数并计算卵裂率。

三、统计学分析  应用SPSS11.0 统计学软件包对数据进行分析处理, 性激素检测结果及获卵数采用 t 检验,卵子第一极体释放率、卵裂率采用Fisher’s检验。

                        结果

一、性激素水平

研究组与对照组小鼠FSH、LH与E2测定值如表1所示,两组性激素测定值有显著性差异。

 

表1 研究组与对照组性激素水平比较

组别

  FSH(mIU/ml)

LH (mIU/ml)

 E2(pg/ml)

研究组

 1.32+0.49*  

 2.08+0.39*   

3.56+0.46*

对照组

4.45+0.72

 15.72+2.38

36.53+1.90

 

二、获卵数 研究组小白鼠获卵56枚,平均每只雌鼠获卵2.80±1.24枚;对照组小白鼠获卵80枚,平均每只雌鼠获卵4.00±1.17枚。研究组与对照组获卵数间具有极显著差异(P=0.0032)。

三、卵子成熟度

    通过第一极体排出情况观察卵子成熟度,两组小鼠卵子第一极体排出情况如表2所示。两组卵子成熟度间有极显著性差异P<0.00001

表2 研究组与对照组第一极体排出率比较

组别

 排出第一极体卵子数

未排出第一极体卵子数

研究组

7(12.5%)

 49(87.5%)    

对照组

 71(88.8%)

9(11.2%)

 

                 

 

 

四、卵裂率

    两组小鼠卵裂情况如表3所示,研究组与对照组间卵裂率具有显著性差异,P<0.00001。

 

 

 

表3 研究组与对照组卵裂率比较

组别

 卵裂卵子数

未卵裂卵子数

研究组

1(14.3%)

6(85.7%)

对照组

50(70.4%)

  21(29.6%)

 

 

         

 

 

                            讨论

卵子的发育以及排卵受下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)的影响,而HPOA的功能又受营养状况的影响。Knigt早在1982年就提出母羊排卵率与其体重有关;杜蕾全等研究发现用低蛋白和高蛋白饲养的母羊排卵率分别为11%和22%,差异明显[1]。Sjoerd G. Elias等对1944-1945年荷兰大饥荒资料进行研究发现,育龄期妇女营养不良可以导致月经紊乱,儿童期女性营养不良可以使月经初潮至规律性月经间隔延长[2]。如果生育期女性长期过度节制饮食,可导致甲状腺功能低下及FSH、LH低下[3]。当体重指数(体重(kg)/身高(m)2)低于18时,不仅会出现排卵紊乱,而且会影响胚胎植入及妊娠结局[4]。

以上学者研究了长期营养不良对动物以及人类生殖功能的影响,但是短期营养不良对生殖功能的影响尚未见报道。在本研究中,研究组小鼠饥饿36小时即导致排卵数、卵子成熟度以及卵裂率明显下降,说明不足一个动情周期(小白鼠动情周期为4-5天)的营养不良也会显著影响卵子质量,从而降低其受精功能。

FSH可促进卵泡中颗粒细胞增生,在少量LH协同作用下,激发颗粒细胞产生E2并促进卵泡液分泌,使卵泡增大。当E2浓度达到峰值时,诱发垂体分泌大量LH,激发卵母细胞减数分裂,促使卵母细胞成熟及排卵。在本研究中,研究组垂体激素FSH和LH以及卵巢激素E2显著低于对照组。这就从内分泌的角度解释了饥饿组雌性小白鼠排卵数减少,卵子成熟度以及卵裂率降低的原因。在HPOA中,下丘脑是垂体的上一级结构,它管理着动物的摄食和内脏功能,还和情绪反应以及应激有关。小白鼠完全禁食36小时,不仅会因营养不良导致全身物质代谢的障碍,而且是一个应激刺激。这二者均有可能影响下丘脑的功能,继而影响整个HPOA的正常运行。

虽然本研究揭示了短期营养不良对雌性小白鼠内分泌及生殖能力的影响,但是,该实验小白鼠的样本量较小。在对小白鼠营养状况与生育能力进行相关性进一步研究时,需要增加样本量。

受该动物实验的启发,我们对我科辅助生殖技术临床工作资料进行了复习。在接受辅助生殖技术过程中,部分患者由于远道而来水土不服,不能正常饮食;部分患者由于超排卵雌激素水平过高恶心、呕吐。虽然没有对这部分患者与正常饮食的患者进行系统的回顾性对比研究(由于饮食摄入量不能准确量化),但总的来说辅助生殖治疗周期不能正常饮食的患者妊娠率较正常饮食组有所降低。类似雌性小白鼠短期营养不良导致生殖能力下降的现象在人类是否存在?如果存在,其机理为何?在辅助生殖实验室技术以及垂体降调、超排卵药物获得长足进步的时代,这两个问题成为摆在生殖医学领域的不容忽视的课题。对这一课题进行研究,对进一步认识女性生殖机理及影响妊娠结局的因素具有重要意义,并且可以对辅助生殖实践起到指导作用。如发现短期营养不良可导致女性生殖功能下降,有可能在辅助生殖技术治疗中通过避开消化道急性疾病期或改善营养摄入等措施提高不孕症治疗的成功率。

参考文献

1、杜雷全、雷国庆 营养对母羊排卵率的效应 草食家畜【J】 1996,91(2):27-31

2、Sjoerd G. Elias, Paulus A. H. van Noord, Petra H. M. Peeters Menstruation during and after caloric restriction:The 1944–1945 Dutch famine  Fertil Steril【J】 2007,(suppl 2):1101-7

3、刘新民 主编 实用内分泌学【M】 北京 人民卫生出版社 2004:2-5

4、John Yovich,Gedis Grudzinskas  The management of infertility【M】   Heineman Professional publishing  Ltd  London  1990:25-30


收稿日期:                 修回日期:

[1] 作者简介:王怀秀(1955年3月1日),男,山西省沁县人,主任医师 从事生殖医学专业

 

本论文发表于《生殖医学杂志》2012年第一期

 

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王怀秀
主任医师/教授
男科
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