HPV持续感染者外周血Th细胞因子的变化
2018年07月27日 【健康号】 赵学良     阅读 7269

人类乳头瘤状病毒持续感染与一过性感染者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞变化
李惠1 赵学良2 王辉2 程芳1 金小力1
目的 了解人类乳头瘤状病毒(HPV)持续感染者与一过性感染者细胞免疫状态的差异。方法 采用基因扩增技术及导流杂交技术检测局部脱落细胞的HPV,根据感染时长分为持续感染组和一过性感染组;选择同期健康体检者作为正常对照组,采用流式细胞技术测定三组受检者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞 )水平。结果 共筛查出HPV感染者143例,其中持续感染者36例,一过性感染者107例,HPV感染者外周血Treg细胞比值水平为(7.72±2.08)%,显著高于正常对照组(5.28±1.21)%(P<0.05),持续感染组为(8.23±2.08)%,显著高于一过性感染组(7.55±2.07) %,(P<0.05)。结论 HPV感染者细胞免疫受抑制,外周血Treg细胞数量增加,持续感染者胞免疫受抑制的程度较一过性感染者更显著。
关键词 HPV持续感染 ;CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞 );细胞免疫
【Abstract】 Objective To understand the differences between the cellular immune status of (human papillomavirus , HPV) persistent infection and a transient infection. Method HPV of local shedding cells were detected by gene amplification and hybridization. According to the duration of infection, the infection group was divided into a continuous infection group and a transient infection group; select health person as the normal control group at the same time. the level of peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells(Treg cells) was detected by flow cytometry in the three groups . Result HPV infection was detected in 143 cases, including 36 cases of persistent infection, 107
基金项目:潍坊市科学技术发展计划项目(201302029)[作者单位]:1、潍坊医学院 山东 潍坊 261052;2、潍坊市人民医院皮肤科 山东 潍坊 261041
[通讯作者]:王辉,E-mail:wanghui_8998@sina.com



cases of transient infection. The level of peripheral blood Treg cells in the HPV infected individuals was (7.72±2.08)% significantly higher than the normal control group (5.28±1.21)%(P<0.05); the level of peripheral blood Treg cells in the 36 cases of HPV persistent infection was (8.23±2.08)% significantly higher than(7.55±2.07)% in the 107 transient infection cases(P<0.05) . Conclusion The cellular immunity in HPV infected individuals was Inhibition ,The number of Treg cells in the peripheral blood of the HPV infected individuals was increased.The degree of inhibition of the cellular immunity of the cases of persistent infection was significantly higher than that of the cases of transient infection.
Key words HPV persistent infection ;CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells(Treg cells) ;The cellular immunity
人体接触人类乳头瘤病毒(HPV)后,并非都会感染HPV,HPV 感染与机体免疫功能密切相关[1],尤其是细胞免疫功能低下或紊乱有密切关系,CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞 )的细胞数量和功能异常与病毒感染性疾病的发生、发展关系密切[2],我们检测了143例HPV感染者外周血Treg细胞水平,其中, HPV持续感染者36例,HPV一过性感染者107例,观察两组HPV感染者细胞免疫功能变化,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 受试者来源于2011年6月至2015年6月我科皮肤科门诊主动要求做HPV检测者和尖锐湿疣患者的配偶及性伴,局部脱落细胞检测HPV阳性但未发生尖锐湿疣。


1.2 诊断 受试者分别于就诊当日和第6个月、第12个月,各检测一次HPV,同一患者两次或两次以上检测到相同亚型的HPV ,认定为HPV 持续感染; 同一患者三次检测仅一次阳性则认定为HPV一过性感染[3]。对高危型HPV感染时间12月及以上,并经阴道镜下宫颈组织多点活检排除宫颈鳞状上皮内瘤变 (CIN)和宫颈癌。病例排除:同一患者两次检测到非同亚型HPV,3个月内接受全身或局部的免疫治疗,患有自身免疫性疾病和其他感染性疾病、应激状态(如妊娠、哺乳及长期服用避孕药等)。
1.3 HPV检测 ⑴ 标本采集 : 用一次性无菌采样刷擦拭男性受试者包皮及龟头冠状沟表面至少三次,将带有脱落细胞的采样棉签放入装有细胞保存液的取样管中,以同样的方法采取女性宫颈口脱落细胞,标本置于-20℃冰箱保存。⑵ 检测方法:采用广东凯普生物化学有限公司提供的人类乳头瘤病毒(HPV)分型试剂盒(PCR+膜杂交法)。采用罗氏480ⅡPCR扩增仪和HybriMax医用核酸分子快速杂交仪。基本原理为基因扩增技术及导流杂交原理,可检测出21种HPV亚型包括6,11,16,18,31,33,35,39,42,43,44,45,51,52,53,56,58,59,66,68,和CP8304(81)。HPV基因亚型检测步骤DNA提取、聚合酶链反应(PCR)扩增、导流杂交等步骤,均严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.4 Treg细胞检测 ⑴ 试剂与仪器:荧光标记单克隆抗体CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE及同型对照小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1- APC、荧光标准微球及破膜固定液均购自美国Beeton Dickinsml公司。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物医学工程研究所。流式细胞仪型号为FACSCalibur 为美国Beeton Dickinsml公司产品。⑵实验方法:抽取静脉血4ml,肝素抗凝。Ficoll密度梯度离心法用淋巴细胞分离液常规分离单一核细胞,调整细胞数为10х106/ml,取两支试管,分别加入100 ?l细胞悬液(1х106),分为同型对照管和检测管。同型对照管加小鼠IgG1-FITC 及IgG1- APC 10l,检测管加CD4-FITC及CD25-APC 10?l荧光标记单抗,室温避光孵育30min;PBS洗涤后,固定破膜,然后同型对照管加IgG1-PE、检测管加Foxp3-PE抗体各10?l,室温避光孵育30min。PBS洗涤后,重悬细胞,上机测定。以CD4+CD25+Foxp3+T细胞/ CD4+ T细胞比值表示Treg细胞水平。
1.5 统计学分析 采用SPSS 19统计软件进行数据处理,外周血Treg细胞比值水平用(x_ ± s)%表示,组间比较采用T检验,多组比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HPV检测结果 共检测受检者208例,共检出HPV阳性者143例,检出率为68.75%,其中HPV持续感染者36例(36/143),其中男16例,年龄17-51岁,平均25.28岁,女20例,年龄19-48岁,平均23.26岁,单一感染17例(17/36),病毒亚型依次为HPV6 8例,HPV11 3例,HPV16 2例,HPV18 2例,HPV58 1例,HPV53 1例。混合感染19例(19/36),HPV6+16 7例 ,HPV11+16 5例,HPV16+18 2例,HPV6+18+53 3例HPV,HPV18+53+33 2例。HPV非持续 感染者107例(107/143),其中男45例,年龄17-55岁,平均25.54岁,女62例,年龄18-50岁,平均21.58岁,单一感染88例(88/107) ,病毒亚型依次为HPV6 65例,HPV11 16例,HPV16 2例,HPV18 1例,HPV58 1例,HPV53 1例,HPV33 1例,HPV52 1例。混合感染19例(19/107),HPV6+18 7例 ,HPV11+16 4例,HPV6+11 4例,HPV6+18+53 3例HPV,HPV16+53+33 1例。
2.2 Treg细胞测定结果 HPV感染组外周血Treg细胞比值明显高于正常人组(P<0.05);HPV持续感染组Treg细胞比值高于HPV非持续感染组和正常人组,三组之间差异显著(P<0.05)见表。

Treg细胞测定结果 (x_±s)%
组别 例数 Treg细胞比值
HPV感染组 143 7.72±2.08a
持续性感染组 36 8.23±2.08b
一过性感染组 107 7.55±2.07
正常人组 32 5.28±1.21

a:与正常人组比较 P<0.05,b:持续性感染组、一过性感染组比较和正常人组之间比较P<0.05。
3 讨论
多数HPV感染可被机体的免疫系统清除而 自愈,仅有少数HPV感染可演变为持续感染。本文共检测受试者208例检出143(68.75%)例HPV感染者,持续感染仅36例,占25.17%(36/143),并且持续感染组HPV混合感染率52.8%(19/36)明显高于一过性感染组的HPV混合感染率18.27%(19/107)。我们认为HPV混合感染更易演变为持续感染,这与多种 HPV 亚型感染可增加持续感染的可能性的观点相一致[4]。
机体的免疫状态对HPV感染的转归起决定性的作用,影响到HPV感染能否被清除或转化为持续感染。在尖锐湿疣的发病机制中, T淋巴细胞及其亚群间的失衡,是感染 HPV的主要原因。人体感染 HPV 后,患者外周血中总 T 细胞及辅助性 T 细胞降低; 抑制性 T 细胞增加; 辅助性 T 细胞与抑制性 T 细胞的比值明显低于正常人,表明细胞免疫功能受到抑制[5]。国内报告尖锐湿疣患者外周血Treg细胞数量增加[6,7]。Treg细胞分泌 TGF-β 在促进自身增殖分化同时抑制 Th1 和 Th2 分化,从而反向调节 Th1和 Th2 介导的细胞毒性 T 细胞活化、免疫应答及炎症反应,使感染持续[8]。
从实验结果我们发现HPV持续感染组外周血Treg细胞比值明显高于HPV一过性感染组,无论是HPV持续感染组还是一过性感染组Treg细胞比值均高于正常对照组,提示HPV感染者细胞免疫功能受到抑制,Treg细胞数量增加;HPV持续感染者细胞免疫功能受抑制的程度较HPV一过性感染者更显著,从而不能诱导有效的细胞免疫应答清除病毒,而导致HPV持续感染。而一过性感染的患者细胞免疫功能受抑制的程度较轻,这或许是不能发展为持续感染的原因。因此,我们认为HPV持续性感染者CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞数量增加更明显,细胞免疫功能受抑制更显著,临床上对于HPV持续性感染者应给予治疗干预和严密随访以防不良后果的发生。

参考文献
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[2] 詹爱琴,刘佩芝.CD4+CD25+调节性T细胞在病毒感染中的免疫调节机制[J].微生物学免疫学进展,2008,36(3):70-73.
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[4] Trottier H,Mahmud S,Prado JC,et al. Type-specific duration of human papillomavirus infection: implications for human papillomavirus screening and vaccination[J]. JInfect Dis,2008,197( 10) : 1436-1447
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[5] 李振,曾耀英,蔡小嫦,等.不同病程尖锐湿疣患者外周血TH细胞亚群的研究[J].中华皮肤科杂志,2003,36(5):253-255.中华皮肤科杂志,2003,36(5):253-255
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[7] 王剑磊,王琪,徐宏俊,等. 尖锐湿疣患者外周血 CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞的检测及其与 HPV 亚型的相关性. [J]中国皮肤性病学杂志,2014,28(6)560-562.

[8] 郝斌,耿霞,高存,等.Th17/Treg 平衡失调与食管鳞状细胞癌浸润转移的相关性. [J]中国肿瘤生物治疗杂志,2012,19:206-209.

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赵学良
主任医师/教授
潍坊市人民医院
皮肤科,外科
结缔组织病、天疱疮、荨麻疹、湿疹、尖锐湿疣、银屑病、甲真菌病、非淋菌性尿道炎
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