循环肿瘤DNA技术能为肺癌的精准诊疗做些什么？

     循环肿瘤DNA（ctDNA），也称为Cell-free tumor DNA或者circulating tumor DNA（ctDNA），ctDNA游离循环于肿瘤病人的血液中。分析ctDNA相对于病人正常基因组的位点突变信息可以微创手段提供肿瘤诊断、预后和肿瘤监测信息。

    很多年以来，科学家一直在寻找非侵入式的癌症标志物—一种存在于血液中的生物分子用以预测疾病。寄希望于可以提供更有效的，病人更易于接受的方法来检测，监视和治疗癌症。随着测序技术的高速发展，大量肿瘤基因组测序研究鉴定了肿瘤发生和进展的基因突变。科学家们发现几乎所有的肿瘤都携带体细胞DNA突变。不同于遗传突变，从父母遗传至下一代，而且存在于身体的每一个细胞，体细胞突变形成于生命过程中任何时期的任何一个独立的细胞。由于体细胞突变只存在于肿瘤细胞DNA，它们是非常特异的可以被检测和追踪的生物标志物。
      尽管肿瘤本身是肿瘤DNA的主要来源，通过活检来获取DNA依然是侵入性的而且有风险，有时甚至是不可能的。幸运的是科学家发现正在死亡的肿瘤细胞会释放DNA小片段到血液中。这些小片段即被称为cell-free circulating tumor DNA(ctDNA)。2014年2月19日发表于Science Translational Medicine的研究，筛选了潜在的体细胞突变的ctDNA，用于检测和跟踪病人肿瘤的进展。研究发现，体内检测到ctDNA的病人的比例与肿瘤进展的时期相关。有47%被检测到ctDNA的病人处在肿瘤Ⅰ期，而55%，69%，82%的病人分别处在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期。而且发现血液中ctDNA的浓度随着肿瘤的进展而增加。科学家测量了206例结肠癌患者血液中ctDNA的浓度，结果发现具有低浓度ctDNA的患者具有显著的较长生存期。
      除了能作为诊断和预后的方法之外，ctDNA也作为检测肿瘤进展和测试肿瘤是否响应靶向药物治疗的评估方法。科学家检测了24例结肠癌患者血液中的ctDNA，这些患者响应针对特定基因的第一轮靶向治疗，但是在后续的治疗中肿瘤仍然有所发展。这些病人的ctDNA被用来筛选治疗前后的突变。研究结果显示新的体细胞突变会在治疗过程中出现以防止药物发生作用。研究者认为测试的ctDNA可以被应用于癌症患者的不同时期，ctDNA在大多数肿瘤的早期和进展期都可以被检测到，提示对大多数患者来说它可以作为一种有效的筛选手段。血液中ctDNA水平的检测方法也可用于快速评估癌症患者所处的时期和存活几率。
      总之，ctDNA是一个非常有效和有益的生物标志物。因为它存在于血液中，提供了一种非侵入性的，因此风险也较低的用于监测肿瘤进展的重复肿瘤活检的替代方法。

今天我们主要讲讲循环肿瘤DNA技术在肺癌精准诊疗中的作用。

1.ctDNA与肺癌的早期筛查及辅助诊断

ILIE等发现对于肺癌的高风险人群来说，可在CT扫描未检测到结节前，通过对CTC的细胞形态学鉴定和检测其上皮－间充质标志物的表达，可以提前预测肺癌的发生；同时还发现在这些高风险患者中检测到的CTC的表型与其组织肿瘤表型相似。由此可见，CTC在肺癌的早期筛查中扮演了一定的角色。PHALLEN等利用靶向错误校正测序（TEC-Seq）的方法对44例健康个体和200例肺癌、结直肠癌、乳腺癌以及卵巢癌患者的cfDNA进行分析评估，分别检测到Ⅰ期或Ⅱ期患者的血浆中的体细胞突变的概率为59%、71%、59%、68%，而且术前较高水平的cfDNA与肿瘤的复发相关；同时研究发现基于cfDNA 的超深度测序分析NSCLC的６个不同基因中的568个突变，灵敏度和分析特异度分别为90.5%和100.0%，这为辅助临床诊断提供了有力的支持。

2.ctDNA指导临床靶向用药

利用液态活检技术对肿瘤基因组进行分析，结合患者具体情况，可指导临床用药。在无法进行组织活检的情况下，Hu等通过分析225例晚期NSCLC患者的CTC中EGFR突变情况以指导临床用药；同样也可以利用CTC中间变性淋巴瘤激酶（ＡＬＫ）基因重排情况来指导 克唑替尼的使用，以促进个体化治疗；研究者同时检测组织DNA和ctDNA中的EGFR突变情况发现两者具有很高的一致性，基于ctDNA检测的EGFR突变情况可以指导晚期NSCLC患者采用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗。在对外泌体的研究过程中发现可 以利用外泌体DNA进行EGFR分子分型和EGFR T790M分析，其结果与组织分子分型的结果具有很高的一致性，而且联合检测外泌体中的DNA/RNA和ctDNA可以提高检测 EGFR的灵敏度和特异度，为患者选择正确的靶向药 物提供强有力的依据。除此之外，关于TEPs的研 究发现凭借RNA测序分析肿瘤（NSCLC、胰腺癌、乳 腺癌等）患者血小板信息，鉴别出癌症亚型的正确率为71%，且能够正确识别突变基因EGFR、KRAS、PIK3CA，对临床用药具有指导意义。目前我们科室对于无法取得组织活检的情况下会常规使用液态活检技术，并且2020年CSCO原发性肺癌诊疗指南中分子分型章节中对于肿瘤标本无法获取或量少不能行基因检测时，可通过外周血cf/ctDNA进行EGFR基因检测（1A类证据）。

3.ctDNA实时监测药物疗效

实时动态监测患者体内肿瘤状态，能够准确把握疾病的发展状况，提高治疗效果，延长肺癌患者的生存期，改善生活质量。有研究者对EGFR-TKI继发耐药患者的CTC进行分析，发现约有80%的患者能够检出与组织检相同的EGFR T790M突变；同样对使用EGFR-TKI药物 的NSCLC患者的ctDNA进行检测，有47%（55/117）的患者发生了EGFR T790M突变，结果 提示临床及时调整用药，以延长患者总生存期；而且NEWMAN等对NSCLC患者的ctDNA的分子特征进行分析，发现存在插入、缺失、点突变以及ALK重排等改变，并证明与影像学相比，ctDNA的分析可以更好地评估患者早期对治疗的反应，并可用于区分残留病变和治疗相关改变。最近的一项研究利用等位基因特异性PCR的方法分析NSCLC患者的外泌体RNA/DNA中的EGFR T790M突变，灵敏度为92%，特异度为89%，可见外泌体在耐药性分析方面的潜力巨大。除此之外，关于TEPs的研究表明TEP具有实时动态监测的潜力，可以比影像学检查更早地提示疾病的进展。

4.ctDNA预后评估分析

CTC和ctDNA代表的肿瘤分子信息以及它们的水平变化在一定程度上可以反映患者的无进展生存期；此外，在对外泌体的分析中发现miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-21-5p的表达上调预示着NSCLC患者有更差的预后；同样在对接受克唑替尼药物治疗的肺癌患者的血小板进行RNA分析时，检测出EML-ALK+的患者无进展生存期为3.4个月，EML-ALK-的患者无进展生存期为16个月。

5.ctDNA筛选出需要强化/维持治疗的患者

①局部晚期 NSCLC，尤其是不可手术的病人，过去标准的治疗是单纯同步放化疗，而目前标准治疗是同步放化疗以后，再接受一年免疫巩固治疗。这一临床治疗模式的改变主要基于 PACIFIC 研究：该研究在同步放化疗后，序贯采用 PD-L1 抗体 Durvalumab 免疫巩固治疗一年，相对于单纯的同步放化疗，无论PFS还是OS，患者都有明显获益。目前数据显示，患者 PFS 时间从 5.6 个月提高到 16.8 个月；最新更新的三年生存率从 43.5%  提高到 57%。可以看出，免疫治疗的加入相较于过去的传统治疗对总体疗效有了很大改变，这也是免疫治疗极大地改变了多种实体肿瘤治疗方式以及治疗结果的一个体现。但问题是 PACIFIC 研究对照组三年生存率也超过了40%，而按照RTOG0617临床研究，单纯采用同步放化疗这组数据的长期随访结果显示患者五年生存率也能达到 32%。也就是说，局部晚期 NSCLC 患者，如果单纯采用同步放化疗，有接近 1/3 的病人可以获得五年生存。而采用免疫治疗的患者三年生存率达到 57%，那么还有 40% 多的病人可能不会从免疫巩固治疗中获益，实际上，免疫治疗只能让小部分局部晚期 NSCLC 患者受益。对于单纯同步放化疗就可以治好的患者，采用免疫治疗对患者来说是过度治疗；对于免疫治疗无效的人群，事实上增加免疫治疗也没有意义，而且增加了患者经济和身体上的负担。因此，局部晚期 NSCLC，即使看到了同步放化疗以后进行免疫治疗所带来的疗效，我们还是要说，这不是一个精准的治疗。因为存在过度治疗和治疗无效的人群。因此，在病人选择的过程中，我们一定要选择通过单纯同步放化疗治不好，而对免疫治疗有效或最可能获益的人群。我们知道，免疫环境是一个动态变化的过程，因此，无论是局部晚期 NSCLC 还是所有晚期实体肿瘤，采用一个动态的指标进行患者总体免疫状况预测，可能会对以后调整治疗方案带来很大的帮助。但是，肿瘤不能一直穿刺活检，因此需要一种相对无创或者非常微创检测手段和方法，合理地获取检测标本，并且能连续动态检测。液体活检就是这样一个技术，它包括的范畴很广，目前临床主要使用的是 ctDNA。最近，Nature Cancer 杂志发表了来自斯坦福大学针对局部晚期 NSCLC 的研究，研究有两个 Cohort，第一个 Cohort 常规采用同步放化疗而不进行免疫巩固治疗。另外一个 Cohort 采用了同步放化疗后进行免疫巩固治疗，免疫治疗药物多数是 Durvalumab，还有一部分患者来自于 Steven Lin 教授的 DETERRED 研究，他们采用的免疫治疗药物是 Atezolizumab。这个研究中，第一个 Cohort 患者在不同时间节点采集了血液样本，观察 ctDNA 在同步放化疗后有没有降低，甚至有没有清零。研究发现，如果病人经过同步放化疗后 ctDNA 清零，预后会非常好。这一点可以理解，因为外周血 ctDNA 来自于肿瘤细胞释放、裂解，在血液中存活时间相对较短，可以实时反映病人总体肿瘤状态。如果经过同步放化疗后 ctDNA 清零，那就是说同步放化疗效果非常好，肿瘤得到了明显控制，没有产生新的 ctDNA 释放到外周血中。那么，这也从侧面反应，局部晚期 NSCLC 患者是否需要免疫巩固治疗，包括可手术病人术后要不要做辅助治疗的问题？对于 ctDNA 清零的病人，很有可能就是那部分过度治疗的病人，同步放化疗的效果已经非常好了，是不是还需要进行免疫巩固治疗呢？第二个 Cohort 同步放化疗后采用免疫巩固治疗的病人也做了类似的工作。对于放化疗后ctDNA 已经清零的病人，的确发现免疫巩固治疗并没有给患者带来总生存获益，而对于放化疗后 ctDNA 没有清零的病人，免疫巩固治疗带来的获益更加明显。根据前面所讲，如果同步放化疗后肿瘤没有得到很好的控制，可能就需要增加另外一种作用机制不一样的治疗手段，给患者带来更明显的治疗效果。这给我们一个提示，如果采用 PACIFIC 研究模式进行治疗，通过液体活检去测定病人外周血 ctDNA 可能是一个很好的选择。发散来想，判断免疫治疗是否出现超进展或假进展的情况，液体活检 ctDNA 检测也是很好的方法。因为真正进展的病人，可能外周血 ctDNA 丰度高，但假进展的病人，实际上是因为 T 淋巴细胞浸润到肿瘤，更多地杀伤肿瘤细胞，它的 ctDNA 丰度反而是下降的。该研究第三部分同样是在免疫巩固治疗的 Cohort 中，是观察免疫治疗早期（免疫巩固治疗开始 11 周左右）外周血样本 ctDNA 的动态变化，是否在某个时间节点得到清零或者明显下降，来判断病人的疗效。结果不言而喻，免疫治疗过程中 ctDNA 清零的病人，最终预后也相对较好。这告诉我们什么道理呢？大家都知道，免疫治疗存在很多争议，在晚期肺癌中的争议是免疫治疗该用多久？基于过去的临床研究设计，认为应该用两年。那么一年可不可以？两年够不够？两年以后还要不要用？临床上非常难判断。局部晚期的病人又用一年，因为研究设计的时候用一年。但是像中国的 PACIFIC5 研究要求一定要用到进展，我觉得这对于很多病人来说，可能就更是过度治疗了。因此，可以通过 ctDNA 检测的方法来探索什么时候停用免疫治疗药物，为病人进行个体化设计，包括免疫治疗的时间。将来，对于在某个时间节点液体活检显示 ctDNA 清零的病人，是不是说明免疫治疗总时间已经够了，对于 ctDNA 没有清零，免疫治疗又有效的病人，是不是要继续用一段时间？

②针对早期可手术根治性切除病人的预后评估，我们曾经做过很多探索，取得过很多成绩，但也走过很多弯路。最初，我们只是根据病人的 TNM 分期比较笼统地去分类，判断病人病情预后的主要标准是，到底有没有淋巴结转移、有多少淋巴结转移。在其后的一系列的研究发现，这并不能解决所有问题。随着精准医学时代的到来，我们发现即使同样分期的病人也有不同的预后，需要精细区分出各种类型的肺癌病人，才能给予针对性的治疗。既往我们曾经尝试过，手术后统一用化疗给病人做辅助治疗。韩国的 LACE 研究回顾性分析发现，手术后化疗的病人，辅助治疗虽然有效，但患者的五年生存率只改善了 5%。第八版分期也表明，Ⅰb 期病人五年生存率只有 73%，Ⅲa 期病人只有 36%；即使术后进行了化疗的辅助治疗，五年生存率也只提高了 5%；数据并不能让人满意。所以，临床迫切需要更多的手段来帮助我们区分和鉴别到底哪些病人属于术后复发的高危风险人群。

我们曾从影像学角度观察，如果病人肿瘤有实性成分，病人的病理学特征有淋巴管脉管癌栓，病人的病灶太靠近胸膜、甚至侵犯胸膜了，都是术后高复发转移的重要因素。那么这些信息够不够？研究发现还是不够，没办法把真正预后非常不好的病人够挑选出来，我们需要借助精准医学的思想，重新看待既往的评估手段。精准医学时代的核心思想是，用高新技术对肿瘤分子特征进行准确的判断，了解病人真正的病因，真正复发转移的风险在哪里？在所有分子生物学检测技术中，最先成熟的就是肿瘤 DNA 检测，我们已经从组织 DNA 进展到液体活检（Liquid Biopsy）里的循环肿瘤 DNA 检测（ctDNA）。未来，ctDNA 技术将会在临床工作或研究中，帮助我们区分真正值得重点关注的病人，精准筛选需要进行后续辅助治疗的患者。手术以后，病人血液里还有没有 ctDNA 呢？深入的 ctDNA 的检测显示：最快在术后 6～24 小时之内就有一部分 ctDNA 已经完全降解；和很多国际结论一致，手术后 48 小时到 1 周的时间内，如果 ctDNA 能够清零，就说明在手术切除肿瘤后、残余 ctDNA 代谢，在患者体内不但有一个肉眼看不到肿瘤的过程，而且有一个 DNA 完全代谢干净的过程，有这样过程的病人一般预后比较好。换言之，如果在术后监测过程中，ctDNA 始终没有降到过零，始终存在，那么目前认为这样的患者很可能存在 MRD 微小残留病灶，要更加注意动态、按时、规律的随访，及时发现这类患者的复发转移的情况。在更后续的监测过程中，还有很多研究给了我们非常重要的提示：ctDNA 的变化有可能早于影像学的监测结果，发现病人是否有复发转移的可能。时间最早能提前 6 个月，一般也会提早 1～3 月的时间。所以未来，我们如果能够用好 ctDNA 检测技术，可提早于常规影像学检测，发现病人潜在复发转移的风险，我认为 ctDNA 技术有很多应用场景和应用价值。最后，ctDNA 检测报告一定要好好解读，关注 ctDNA 检测出来的基因和原来组织学里检测的基因是否相同，还是有一些新的基因出现？如果动态监测到像 EGFR 这样非常明确的驱动基因，根据治疗结果，我们会发现，可能存在耐药的情况，ctDNA 检测还能为我们提供一些耐药的真正原因。ctDNA 不仅是病情是否复发转移的一个预测因素，而且还能指导我们更加精准地选择进一步的治疗方案。未来，ctDNA 在早期肺癌微小残留病灶的监测、动态的监测和决策的过程中，一定会发挥越来越重要的作用，所以这也是我们临床医生需要掌握的非常有力的武器。

总结