胃癌前病变及胃癌患者血清及组织Hp的检测及意义

臧爱华1 冯觉平3、王洪波2、等 

  1 湖北省肿瘤医院综合科湖北省肿瘤医院肿瘤内科臧爱华

    2 湖北省肿瘤医院功能检查科内窥镜室

3 武汉市普爱医院肿瘤科

摘       要

目的  探讨HP感染与胃癌前病变、胃癌发生的关系；探讨血清与胃组织HP表达的相符性，为胃癌前病变的监测和治疗提供依据，为早期发现、诊断和治疗胃癌提供参考指标.

方法   采用免疫层析一步法、蛋白芯片法测定血清HP，免疫组化S-P法测定胃组织HP，对324例胃疾患病例进行检查分析，其中经病理确诊的胃癌111例，癌前病变170例，其余为浅表性胃炎。

结果  癌前病变的各阶段及胃癌患者的血清及胃组织中均可检测到Hp，血清及胃组织中Hp的检出率以胃癌前病变组最高，胃癌组次之，浅表性胃炎中检出率较低。三组之间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），各组与正常组之间差异也均有统计学意义（P＜0.05）。胃组织Hp检出率明显高于血清。

结论  HP参与了胃癌前病变和胃癌的发病过程，可把血清及胃组织Hp检测作为对癌前病变的初步监测及治疗观察指标之一。血清HP检测简便易行，可作为普查内容，对血清HP阳性的病人建议做胃镜组织学检查及组织HP检查。

关键词   胃癌前病变  胃癌  幽门螺杆菌

Abstract

Purpose 

To provide the basis for early detection and treatment of precancerous lesions of gastric carcinoma ,and reference for early discovery, diagnoses and treatment of gastric cancer, by examining the differences of expression of Hp, both in the gastric mucosa and in blood serum, between precancerous lesions of gastric carcinoma patients and gastric cancer patients.

Methods

We use immunochromatographic method and Protein Chip System to determine the expression of helicobacter pylori in blood serum and use immunohistochemistray to detect the expression of helicobacter pylori in gastric mucosa. The patients had been diagnoses by pathological methods，170 patients with precancerous lesions of gastric carcinoma, 111 patients with gastric cancer and 39 patients with superficial gastritis.

Results  

The expression of Hp was detected on every stage of precancerous lesions and gastric cancer. Compared by the detection rate of Hp, precancerous lesions group was higher than gastric cancer group and superficial gastritis group, superficial gastritis group was the lowest. The differences of the three groups were significant (P <0.05). The detection rate of Hp in the gastric mucosa was obviously higher than in blood serum.

Conclusion

Hp participates in the process of the precancerous lesions and gastric cancer. The expression of Hp both in the gastric mucosa and in the blood serum could be one of the indexes, which might report the process and curative effect of precancerous lesions. With such advantages as simple and applicability, the detection of Hp in the blood serum could be used widely. The endoscopy and the detection of Hp in the gastric mucosa are suggested for patients with Hp positive in the blood serum.  

Keywords  precancerous lesions；gastric cancer；Helicobacter pylori (Hp)          

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率均居我国各种恶性肿瘤首位平均年死亡率为16/10万，高发区达60/10万[1、2]。胃癌的发生是一个多阶段、多因素进行性发展的过程。慢性浅表性胃炎（CSG）→慢性萎缩性胃炎（CAG）→胃黏膜肠上皮化生（IM）→胃黏膜不典型增生（ATP）→胃癌(GC)[3]是目前医学界公认的胃癌发生过程。慢性萎缩性胃炎与胃息肉、残胃炎、胃溃疡被称为胃癌前疾病，而在慢性萎缩性胃炎基础上发生的胃黏膜肠上皮化生和不典型增生被称为胃癌前病变，两者统称为胃癌前状态。

胃癌前病变的发生与幽门螺杆菌（Hp）感染有着密切的关系[4,5]众多研究表明，Hp感染可能是胃癌发生的始动因素，它可能是慢性胃炎向萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生及胃癌发展的启动因子。换言之，Hp感染与胃癌危险性增加密切相关。因此，了解Hp感染与上述疾病的关系，并阻断上述环节，对于预防胃癌的发生十分重要。

对象及方法

1  研究对象   本组324例胃疾患病例均为2003年8月至 2007年4月在我科住院、门诊患者。其中男214例，女110例。年龄35-80岁，平均59.6岁。根据胃镜及病检结果将全部病例分为4组。（1）胃癌组：111例，男性73例，女性38例，年龄46-76岁，平均63.4岁。（2）癌前病变组：170例，年龄20-82岁，平均53.8岁；为慢性萎缩性胃炎104例，男性65例，女性39例；胃溃疡31例，男性25例，女性6例；胃黏膜肠上皮化生32例，男性25例，女性7例；残胃炎3例。男性1例，女性2例。（3）对照组：取自浅表性胃炎及正常人胃镜活检标本，其中浅表性胃炎31例,男性16例，女性15例，年龄42-74岁，平均54.8岁。另取正常人（功能性消化不良）胃镜活检标本12例。

病例分组均经胃镜及胃组织活检病理学证实。各组患者常规作肝B超/CT、胸片或CT检查, 并抽取外周血作Hp检测；同时检测胃组织Hp表达。

2  方法

2.1  胃组织标本采集    所有入选病例均行常规电子胃镜检查，在胃镜检查前取病人空腹血4m1分离血清备用。于胃黏膜病变部位用活检钳(活检钳直径约0.5cm)取3-7块病变组织送病理科进行病理诊断。

2.2  血清Hp检测方法    严格参照试剂盒操作步骤，采用免疫层析一步法检测血清Hp，具体如下：（1）抽取患者空腹外周静脉血4ml,分离后取血清。－20℃保存待测。（2）吸取10ul全血加入标本稀释管（1.2ml标本稀释液）中，进行1/120稀释；或吸取5ul血清或血浆加入标本稀释管（1.2ml标本稀释液）中，进行1/240稀释。充分混匀。（3）从包装袋中取出反应板置于工作台上（标本滴加后两分钟内不得触碰反应板）。用原先包装中提供的吸管逐步垂直滴加4滴（约160ul）稀释后的标本于反应板的加样孔中（加样过程中，滴与滴之间应有短暂的停顿！）。（4）在加样后的5-10分钟内判断结果。

2.3            胃组织Hp检测(S-P法)  二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒及多克隆兔抗幽门螺杆菌试剂均购自上海基因公司。

石蜡切片经常规脱蜡水化后，以3%的H2O2（80%甲醇）温育15 min 灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3 次，每次5 min；微波抗原修复5min，0. 1 mol / L PBS 洗涤3 次，每次5 min；滴加正常血清封闭液，室温温育30 min，除去多余液体；滴加一抗，将多克隆兔抗幽门螺杆菌工作液50ul于组织上，平放于湿盒中，室温孵育30min；PBS缓冲液中浸泡3次，每次5min，擦干组织周围的PBS液。滴加二抗：将二抗ChemMateTMEnVision+/HRP于组织上，平放于湿盒中，室温孵育30min；PBS缓冲液中浸泡3次，每次5min，擦干组织周围的PBS液。滴加显色剂，将预备好的显色剂DAB工作液50-100ul，平放于湿盒中孵育5-10min，显色完全后，用蒸馏水冲洗，终止显色。苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

3  判断标准

3.1  血清幽门螺杆菌结果判断标准    在检测显示窗和质控显示窗中同时出现肉眼可见的清晰的红色线条即可判断为阳性结果；仅在质控显示窗中出现一条肉眼可见的红色线条，而在检测显示窗中则无有色线条出现则判断为阴性结果；若质控显示窗中无红色线条出现，通常为反应板受损，应用一新反应板重新检测。

3.3  胃组织活检标本HP检测结果判断标准    Hp免疫组化染色为黄色或黄棕色，物质定位均位于细胞浆。每张切片在高倍镜下随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞率，阳性细胞<10%为（-），11%-30%为（++），31%-50%为（+++），>50%为（+++）。

4  统计学处理    实验结果用SPSS10.0统计分析软件进行处理，所有数据以均数±标准差表示。各组间采用X2检验，t检验，检验水准以P＜0.05为检验有显著性差异的界值。

                        结      果

1  不同胃疾病的年龄分布    胃疾病一般以35岁以上发病为甚，其中胃癌前病变发病的平均年龄为53.8岁，浅表性胃炎54.8岁，胃癌的平均年龄为63.4岁。胃恶性疾病的发病年龄明显高于非恶性疾病。

2  溃疡病的性别分布    胃疾病男女例数比为1.95:1，，男性＞女性。其中胃癌前病变男女例数比为2.15:1，胃癌男女例数比为1.92:1，浅表性胃炎则为1.06:1。在胃癌及癌前病变中，男性明显多于女性。

3  不同胃疾病血清Hp的检出率    如表1所示,胃癌前病变相关组血清Hp阳性检出率最高,由高到低依次为慢性萎缩性胃炎组90.4%（94/104）、胃黏膜肠上皮化生组68.8%（22/32）、胃溃疡组64.5%（20/31），平均为80.6%（137/170）；胃癌组次之，为52.2%（58/111，）,浅表性胃炎组最低（10/31，32.2%）。胃癌组、癌前病变组与浅表性胃炎组三组之间差异有统计学意义（P<0.01）。胃癌组与癌前病变组间比：胃癌组分别与慢性萎缩性胃炎组、胃黏膜肠上皮化生组之间差异有显著性（P<0.01）；胃癌组与胃黏膜肠上皮化生组及胃溃疡组之间均未达到统计学上显著性差异（P>0.05）。                                                                

表1   不同胃疾病患者血清HP阳性结果

     组     别

总例数

阳性例数

HP阳性检出率%

胃癌组

慢性萎缩性胃炎组

胃溃疡组

胃黏膜肠上皮化生组

残胃炎组

浅 表 性 胃 炎 组

正常对照组

111

104

31

32

3

31

12    

58

94

20

22

1

10

0

52.5

90.4

64.5

68.8

33.3

32.3

0

卡方检验结果：（1）胃癌、癌前病变组与浅表性胃炎组比较P均<0.05；（2）胃癌组与慢性萎缩性胃炎组比较P均<0.01；胃癌组与其他癌前病变组P均>0.05。

4  不同胃疾病组织Hp的检出率   如表2所示，癌前病变组组织Hp的检出率最高，为86.2%(144/167),各亚组由高到低依次为：慢性萎缩性胃炎组92.3%（96/104)（图1）,胃溃疡组77.4%（24/31）（图2）,胃黏膜肠上皮化生组75.0%（24/32，）（图3）；其次为胃癌组的66.7%（74/111）（图4）。浅表性胃炎中Hp的检出率为38.7％（12/31)（图5）, 12例正常胃黏膜中未检出Hp。

胃癌前病变组与浅表性胃炎组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；胃癌前病变组中个亚组（慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃粘膜肠上皮化生）的Hp检出率分别与浅表性胃炎组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；

胃癌组的Hp检出率低于上述3组，与慢性萎缩性胃炎组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；与胃溃疡、胃粘膜肠上皮化生组之间均未达到统计学上显著性差异（P>0.05）。残胃炎例数太少，不参与统计。

各组与正常组均有显著性差异。

表2   不同胃疾病组织Hp的检出率

组   别

总例数

HP阳性例数

HP阳性检出率%

胃癌组

慢性萎缩性胃炎组

胃溃疡组

胃黏膜肠上皮化生组

浅表性胃炎组

正常对照组

111

104

31

32

31

12    

    74

    96

    24

    24

    12

    2

66.7

92.3

 77.4

75.0

 38.7

  16

卡方检验结果：（1）胃癌、癌前病变组与浅表性胃炎组比较P均<0.01；（2）胃癌组与慢性萎缩性胃炎组比较P<0.01；胃癌组与其他癌前病变组比较P均>0.05。

  表3   HP阳性程度

组   别

总例数

-

+

++

+++

胃癌组

慢性萎缩性胃炎组

胃溃疡组

胃黏膜肠上皮化生组

浅表性胃炎组

正常对照组

111

104

31

32

31

12        

24

17

11

3

16

12

32

35

20

5

0

0

48

0

0

12

10

0

7

52

0

12

5

0

胃疾患中幽门螺杆菌免疫组化染色 

图1 萎缩性胃炎                                  图2 胃溃疡 

图3 胃黏膜肠上皮化生                                 图4  胃癌 

图5浅表性胃炎（阳性）                          图6浅表性胃炎阴性对照

讨       论

图11胃溃疡                  图12 浅表性胃炎阴性表达

  胃癌的发生目前尚不十分清楚，可能是环境与遗传因素的相互作用。大量基础及临床研究提示，Hp感染是诱发胃癌的重要因素之一，它可能是胃癌的协同致癌因子。

自从1983年Mashall和Warren成功地从胃炎和消化道溃疡病人中分离出Hp才引起广大学者的关注，并逐步认识到Hp是慢性胃炎和消化道溃疡的主要病因，与胃癌的发生亦有密切的关系[4,5]。1994年WHO国际癌症研究机构把Hp列入I类致癌危险因子[6]。我国学者于近期就Hp与胃癌关系达成某些共识，认为Hp可增加胃癌发生的危险性，Hp与肠型和弥漫型胃癌均有关。有关Hp感染引发胃癌的机制，目前普遍认为在长期Hp感染所致的慢性活动性炎症过的程中，通过一系列致病因子(如尿素酶、空泡毒素、毒素相关基因蛋白、炎症介质、反应氧代谢产物等)直接或问接的攻击作用，引起了胃黏膜上皮细胞增殖过度，凋亡异常以及一系列组织病理学变化，从而最终导致了胃癌的发生[7] 。

目前对Hp的检测多限于血清及胃液，这些都是对Hp的间接观察，不及对胃组织的直接检测客观。而血清Hp的与组织Hp检测的相符性也值得探讨。

有鉴如此，本研究系统观察了324例胃癌前病变、胃癌患者的发病情况，同时检测了上述患者血清Hp及胃组织Hp表达，详细对比了胃癌形成过程中，不同病变阶段Hp的感染状况， 结果显示，（1）除正常胃黏膜外，其余各种胃疾病组织中均有不同程度的Hp感染，其中胃黏膜肠上皮化生组和萎缩性胃炎组最高，浅表性胃炎患者检出率最低。但胃癌患者中Hp感染率明显低于萎缩性胃炎组、肠上皮化生组。（2）在胃黏膜肠上皮化生、萎缩性胃炎及胃溃疡等癌前病变患者的血清中HP的检出率分别为68.8%、90.4%、64.5%，稍低于组织中HP的检出率；胃癌患者的血清中HP的检出率为52.2%，与组织HP的检出率基本相符。从而证实了HP参与了胃癌前病变和胃癌的发病过程，且是其重要病因之一。

既往研究发现，幽门螺杆菌(Hp)是一种微需氧革兰氏染色阴性的、呈s形或弧形弯曲的细菌，它可以持续性、特异性地自然定植于人胃黏膜，大量研究表明，Hp是慢性胃炎、胃溃疡的独立致病因子，也是胃癌的启动因子[4,5]。我们在大部分癌前病变的各阶段及胃癌患者的血清及胃组织中均检测到Hp，胃组织Hp检出率明显高于血清。提示Hp与胃癌前病变及胃癌关系十分密切，胃组织中Hp的检测更准确。但由于血清Hp的检测更便利，且与胃组织中Hp表达比较一致，故可把血清Hp检测作为对癌前病变的初步监测及治疗观察指标之一。

在以往的研究中，通过胃镜钳取标本，胃癌Hp检出率高低不等，我们的研究结果显示胃癌患者Hp检出率反而低于胃癌前病变患者 ，这一结果与Prabhu 、Matsu-kura 等研究结果相近[8]。我们考虑胃癌组织中Hp检测率低于癌前病变的原因可能是由于胃癌所致胃内Hp生存环境改变，使在不利于其生长繁殖的环境中发生细胞壁缺失而导致球形变[9],从而未能检出。并非是胃癌患者的Hp感染率低之故。有文献报道，球形Hp对环境的适应能力强，在癌组织中的检出率高[10]，它可能是Hp在组织中潜伏的形式[9-11]。由此可见，从浅表性胃炎-萎缩性胃炎-肠腺化生-异型增生-胃癌的胃腺癌发生模式中，Hp感染呈先升高后下降趋势，说明Hp感染主要参与胃癌前病变的早期阶段。日本学者Asaka[12]检测胃癌病人血清中抗-HP IgG明显高于非胃癌病人，同样提示胃癌发生过程中，曾有高的HP感染。我们的结果与其相符。

此外，在我们的观察中还发现胃癌前病变及胃癌的发病率男性明显比女性高，以35-60岁年龄段多见。这可能是因为这个年龄段劳动强度大，生活习惯和饮食习惯在一定程度上受工作环境的影响所致。

由于Hp感染以中青年为主，因此对高发病率人群进行Hp动态检测，清除Hp感染，纠正生活和饮食习惯，提高胃黏膜的防御机能，有助于减少胃癌的发生。

我们知道，从Hp感染引起胃炎到最后胃癌的发生可能需要十几年到几十年的时间，在此过程中，胃癌发生的每一个步骤中都有各种致病因子或基因产物单独或协同作用。Hp感染可能是胃癌发生的始动因素，它可能是慢性胃炎向萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生及胃癌发展的启动因子。它定植于胃黏膜并与其它因素共同作用导致了胃黏膜萎缩及胃癌的发生[13,14]。因此对Hp阳性的癌前病变患者动态检测血清及组织Hp更有助于对胃癌的早期发现、早期诊断和早期治疗。

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2003年湖北省科研课题

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