现在临床上用的宏基因二代测序检查,即高通量测序检查项目,在三甲医院普遍被应用,价格昂贵,而且属于自费项目。我们来进一步认识一下这项高通量测序检查项目的详细分类和最新检测技术进展。
感染性疾病是全球致残和致死的主要疾病之一,对于感染性疾病致病性微生物的检测一直是临床上的重点。传统的病原体检测技术面临培养阳性率低、时间长、难以检出苛养菌等局限性、近年来,高通量测序( high - throughput sequencing , HTS )的快速发展给病原体的检测带来新的突破, HTS 在临床实验室中最常见的应用包括宏基因组高通量测序( metagenomics high - throughput sequencing , mHTS )、全基因组测序( whole genmoe sequencing , WGS )、靶向高通量测序( targeted high - throughput sequencing , tHTS )等。目前, mHTS 应用最为广泛。
mHTS 测序深度大、覆盖面广、测序效率高,可以在一次测序过程中测出样本中所有的核酸序列,在检测出病原微生物的同时对病原体进行种属鉴定。
相较于传统的病原学检测, mHTS 的优势如下:①更高的灵敏度和准确性,弥补了传统病原学检测方法的不足:②更快的检测速度,可以早期提供临床信息;③更广的检测范围,可以同时检出临床标本中的细菌、真菌、病毒、非典型病原体和寄生虫,在检测罕见、新发病原体方面更具有优势:④检测结果受抗菌药物经验治疗的影响小。
mHTS 的局限性如下:①检测结果易受人源序列的影响:②同时只能进行单一的脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid ,DNA )或核糖核酸( ribonucleic acid , RNA )测序;③价格昂贵等;④结果解读困难;等等。 mHTS 仍在不断地创新和发展, tHTS 的出现从技术原理上弥补了 HTS 在病原学诊断中的部分不足。
一、靶向高通量测序的技术原理
tHTS 是一种基于 HTS 的靶向富集的测序技术,通过对目标基因组感兴趣区域( regions of interest , ROI )进行富集,确保 ROI 有足够的测序深度和覆盖度,这是确保 HTS 应用有效的关键步骤,目前, tHTS 的靶向富集技术主要分为2种:基于超多重聚合酶链反应( polymerase chain re - action . PCR )扩增的 PCR 扩增法和基于探针杂交捕获的探针杂交法。
1.基于超多重 PCR 扩增的 PCR 扩增法
其主要流程是针对感兴趣的目标基因区域,利用目的基因区域两侧的序列设计多重 PCR 引物进行扩增富集,并将这部分区域放大几千倍并进行测序。在核酸序列数量和质量有限的情况下,该方法也可以产生足够的序列进行测序。通常需要多个引物同时工作,得到的扩增序列需要测序适配器连接完成文库制备,之后进行测序分析。
2.基于探针杂交捕获的探针杂交法
根据目的基因区域设计具有特异性序列的单链寡核苷酸(被称为"探针"或者"诱饵"),这些探针可以是 RNA 或 DNA ,与特定基因组序列杂交后分离,以捕获目标基因组序列。捕获成功后进行测序适配器连接和少量 PCR 循环,以富集成功连接的片段并进行测序分析。与 DNA 探针相比, RNA 探针在与 DNA 序列结合时具有更好的杂交特性和更高的稳定性,从而提高捕获的总体效率。 RNA 相对不稳定限制了其使用,而 DNA 探针应用更为广泛。
以上2种方法对比,基于超多重 PCR 扩增的 PCR 扩增法具有核酸需求量低,工作流程更快、更简单,脱靶测序率更低,适用于目的基因靶点较少的样本,但其测序失败率相对较高。基于探针杂交捕获的探针杂交法虽然无基因靶点数量的限制,且测序失败率低,但其工作流程更加复杂、核酸需求量高。总的来说,上述这2种方法均适用于 HTS 目标富集,具体选择哪种方法,应根据测序目的和测序条件综合考虑。
与 mHTS 相比:① tHTS 针对特定的病原微生物序列进行扩增,可以减少甚至无视人源序列对检测结果的影响;② tHTS 可以同时进行 DNA / RNA 测序,可以一次检测包括 RNA 病毒在内的病原微生物;③由于 tHTS 的病原检测图谱是经过筛选的,检测病原微生物的种类有限,故所需成本更低。
二、靶向高通量测序的临床应用
1.靶向高通量测序对病原微生物的检测效力
传统病原学检测方法,灵敏度低、耗时长。现有的分子诊断方法,如定量聚合酶链反应( quantitative polymerase chain re - action , qPCR )检测范围窄, mHTS 在技术原理上仍存在诸多不足。 tHTS 作为新兴的 HTS ,在技术原理上弥补了传统病原学检测的不足,改正了 mHTS 的一些缺陷。
Li 等设计了一个包括153种呼吸道感染病原体的 tHTS 测序平台,可以覆盖95%的常见呼吸道感染病原体。结果显示,102例呼吸道感染患者中 tHTS 的检出率为82.17%, mHTS 为86.51%,两者检出率的差异无统计学意义( P =0.41)。 tHTS 的成本仅为 mHTS 的1/4,故在保持高灵敏度的基础上, tHTS 在成本方面更具有优势。 tHTS 可以同时进行 DNA / RNA 测序,一次测序就可以完成对细菌、真菌、病毒和非典型病原体的检测。此外, tHTS 还单独检出了鼻病毒,其在临床应用上更具实用性。
临床上常需要面对多种病原微生物引起的感染,这就需要一种能同时检测多种微生物的技术手段。研究表明, Sanger 测序在检测多重感染标本时,通常无法解释检测结果。虽然, mHTS 有助于多重感染的鉴定,但是并不能有效区分定植菌和病原菌。近年来,有研究提出基于16S rRNA 的 HTS 在多重微生物感染标本中有准确鉴定病原微生物种及定量细菌丰度的能力。 Pitashny 等进一步探索了基于16SrRNA的 tHTS 对多重感染的检测效力。研究发现,在 Sanger 测序阴性的标本中, tHTS 检测出8例阳性,均为多重细菌。 Robin 等纳入了2146例临床实践中的组织和液体标本,包括肺组织、浆膜液、骨组织、脑脊液、脓肿组织、心脏瓣膜等,分别使用培养方法、 Sanger 测序及 tHTS 对标本进行检测。在肺组织中,相较于 Sanger 测序, tHTS 的阳性率提高了300%。多重感染标本, tHTS 具有强大检测能力,故早期选择 tHTS 具有重要临床价值。
tHTS 对低载量微生物、苛养菌的检出也具有优势。研究发现,利用靶向捕获技术结合 mHTS 可以增加90%病毒核酸的载量,从而扩大目标微生物检测覆盖度,提高检测的可信度。研究表明,通过靶向捕获富集后,检出病毒的序列数增加了674倍,病毒基因组的覆盖度从2.1%提升至83.2%。得益于覆盖度的提高,捕获的 tHTS 可以用于分析基因组变异度高达58%的指环病毒。由此可见, tHTS 在一定程度上降低了检验结果的解读难度,更适合在临床上被广泛使用。
综上所述, tHTS 对于病原微生物的诊断效力不亚于现有分子诊断技术,且弥补了现有分子诊断技术的部分不足,在临床应用上具有更广的适用范围。此外,在不同类型的临床样本中, tHTS 也被证明了其在诊断方面的潜能,具体的诊断效力仍需要更多针对性的研究来探索。
2.靶向高通量测序对耐药基因的检测效力
基于培养的药敏试验是临床最常用检测耐药细菌的方法,但其过程烦琐、需要专业人员解读结果、灵敏度低。 mHTS 得到的微生物测序序列数不足样本总序列数的5%,故无法胜任耐药基因的解读任务,而基于 tHTS 的新一代耐药基因检测技术将有助于临床快速检测耐药基因。
Wu 等的研究比较了 tHTS 与表型药敏试验( phenotypic drug susceptibility testing , DST )对结核耐药基因检测的结果。结果显示, tHTS 的灵敏度和特异度分别为97.0%和99.1%,与 DST 结果高度一致。可见, tHTS 对耐药基因的检测具有高度灵敏性。 Sibandze 等使用 tHTS 检测患者的粪便标本并同时进行耐药性预测。56例结核患者中 tHTS 检测出38例(68%),同时38例阳性患者中的28例(74%)检测出的结核分枝杆菌复合体耐药性预测报告,与痰 DST 结果高度一致( k =0.82)。 tHTS 在检测结核分枝杆菌同时可以检测耐药基因,极大地缩短了时间。另有研究发现,结核病患者, tHTS (75.5%)与结核分枝杆菌及
利福平耐药基因检测( GeneXpert MTB / RIF , Xpert )灵敏度(74.5%)高度一致。因此,在结核的诊断中, tHTS 具有一定的指导意义。
Patricia 等纳人了201例支气管肺泡灌洗液样本,分别进行 mHTS 、 tHTS 及抗菌药物敏感试验( antimicrobial susceptibility testing , AST )。结果显示, mHTS 的总体准确性为67.1%, tHTS 的总体准确性为65.6%,2种检测方法具有相似的检测效力。其中, tHTS 检测出16种具有耐药标志物的潜在病原微生物, AST 检测出13种可评估表型耐药性的病原微生物, tHTS 检测出的耐药表型与药敏试验结果的一致率为54.8%。在1例大肠埃希菌与铜绿假单胞菌混合样本中,药敏试验提示大肠埃希菌对
美罗培南敏感,而 tHTS 检测出 BLAOXA 基因。铜绿假单胞菌产生 BLAOXA 基因是本例基因型和表型矛盾的原因。该研究认为, tHTS 检测耐药基因需要考虑基因的突变、耐药表型和基因型,以制定更完善的结果解读方法。
总之,现有的基于 tHTS 的耐药基因检测技术灵敏度不弱于传统方法,且适用于多种标本。未来随着 tHTS 的,该技术将部分取代传统药物敏感试验,在指导临床用药方面发挥重要作用。
目前, tHTS 还存在一些不足:① tHTS 的检测结果是根据已知病原体设计的,只能检测设计目标范围内的病原体,无法检测出新发病原体,在临床实践中需要根据具体的需求设计针对性的病原体谱;②测序前的文库制备需要大量人工和时间成本,且操作人员需要具有较高的专业水平。
综上所述, tHTS 作为一种新兴技术在呼吸系统感染的临床应用中具有极大的潜能。相较于 mHTS , tHTS 可以针对临床初筛需求设计检测范围,覆盖常见病原体、简化解读流程、靶向扩增针对性提高病原体的检出可信度。未来,随着 tHTS 的发展,其应用有望得到更大的拓展。