[摘要]  目的 检测先天性巨结肠症患儿血清蛋白质，筛选特异的蛋白质标记物，构建用于先天性巨结肠症早期筛选及诊断的血清蛋白质指纹图谱模型。郑州大学第一附属医院小儿外科陈新让

方法 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检测82例血清标本（先天性巨结肠症42例，其他类型肠梗阻20例，正常对照20例）的蛋白质质谱，并结合生物信息学方法（支持向量机）分析数据。

结果（1）先天性巨结肠症组与正常对照组比较：筛选出3个M/Z位于3221.7、5639.2、6884.2的蛋白质标记物，构建先天性巨结肠症早期筛选及诊断模型，3标记物在先天性巨结肠术前组低表达，与正常对照组有显著性差异（P﹤0.01），其在先天性巨结肠术前组和正常对照组的表达强度分别为378.29±273.34、295.65±159.38、444.13±254.06和1428.18±1192.61、1039.60±785.64、1115.72±680.48。经留一法交叉验证，区分先天性巨结肠和正常小儿的血清蛋白质指纹图谱模型的特异性为100%，敏感性为100%. （2）其他类型肠梗阻与正常对照组比较：在2个M/Z位于2694.2、3520.2位点上无显著性差异（P﹥0.05）。

结论 SELDI-TOF-MS结合SVM建立先天性巨结肠症血清蛋白质指纹图谱模型是早期筛选及诊断先天性巨结肠症的一种特异性强、敏感性高的新方法，值得进一步研究和应用。

[关键词]  先天性巨结肠症；诊断； SELDI-TOF-MS； 支持向量机 ；蛋白质指纹图谱

先天性巨结肠症(Hirschsprung disease，HSCR)是小儿外科较为常见的消化道畸形,目前所使用的临床检查手段，尚不能满足对先天性巨结肠早期筛选及诊断的要求。而表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization time of flight Mass Spectrometry, SELDI-TOF-MS)是近年发展起来的一种新的蛋白质研究技术[1],具有快速、简便、高通量及对多样本平行检验的优点[2]我们对先天性巨结肠患儿和正常小儿的血清蛋白质进行检测，筛选出特异的蛋白质标记物，建立先天性巨结肠早期诊断模型。

材料与方法

1.临床资料 血清样本共82例均来自郑州市儿童医院和郑州大学第一附属医院小儿外科，其中先天性巨结肠42例（长段型9例，短段型31例，超短段型2例），其他类型肠梗阻20例（阑尾炎术后粘连性肠梗阻12例，梅克尔憩室术后粘连性肠梗阻3例，炎症性肠梗阻5例），正常对照组20例来自本院小儿外科门诊体检的健康小儿。所有先天性巨结肠症标本均经病理学结果证实。先天性巨结肠症中男37例，女5例，年龄5天-18岁。其中5例新生儿入院后出现巨结肠危象而急诊行结肠造瘘术。所有全血标本均在清晨空腹时抽取，室温下静置1-2小时后3000转离心10min，提取血清-80℃保存。

2.主要仪器和试剂:  Ross Temp Inc，Ciphergen PBSⅡ+ SELDI-TOF-MS和WCX2蛋白芯片，ORBIT300，Nuaire，Bioprocessor，Wallac 1296-003 DELFIAPLATESHAKE,均购自美国Ciphergen公司；Milli-Q Plus购自Millipore inc公司; CHAPS, Urea, DTT, NaAc, SPA(Sinapinic acid)均购自美国Promega公司。

3SELDI操作的技术路线:  样本冰融，4 ℃10000 rpm离心2 min;取96孔板，放冰盒上，每孔加U9(9M Urea，2%CHAPS，1%DTT) 10μl，血清5μl，4 ℃层析柜600 rpm振荡30 min;振荡结束前15 min做芯片预处理，芯片装入Bioprocessor中并记下芯片号；每孔加NaAC(100 Mm, pH4) 200μl，层析柜中600 rpm，5 min，重复1次;U9处理后96孔板放冰上，快速加入NaAC185μl在层析柜中6000 rpm振荡2 min;加已处理好的样本100μl到芯片，层析柜4 ℃ 600 rpm振荡1 h，甩干，重复3次；用hplc水200μl洗2次快速甩干；用50％饱和的SPA 1μl重复2次;上机检测;将芯片放入Ciphergen读谱仪中检测。

4.数据收集与处理： 用protein chip software 3.1做校正，使总离子的强度及分子量均一化。应用ZUCI-Protein Chip Data Analyze System 软件包进行分析。原始数据用离散小波（undecimated discrete wavelet transform)分析去除噪音,并减掉基线。聚类分析以10%为最小阈值，将各个样本中M/Z的差异小于0.3％的峰聚为一类。支持向量机(support vector machine, SVM)特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法建立判别模型，用留一法交叉验证作为评估模型判别效果。

5.统计学分析　所有初步筛选出的质荷比做Wilxonxon秩和检验，检验标准设为＝0.05。

结   果

1.先天性巨结肠症组与正常对照组  先天性巨结肠症组和正常对照组的质谱数据经过初步过滤筛选得到213个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰13个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的youden指数最高的组合模型，筛出M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的标志物3个，3标记物在先天性巨结肠术前组低表达，与正常对照组有显著性差异（P﹤0.01），其在先天性巨结肠术前组和正常对照组的表达强度分别为378.29±273.34、295.65±159.38、444.13±254.06和1428.18±1192.61、1039.60±785.64、1115.72±680.48。在先天性巨结肠低表达，在正常对照组高表达（图1）。联合三个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检测，在测试集上判别模型的特异性为100%，敏感度为100%。

表1：先天性巨结肠和正常对照组的M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2的统计资料

组别

n

3221.7(Mean±SD)

5639.2(Mean±SD)

6884.2(Mean±SD)

p

先天性巨结肠组

42

378.29±273.34

295.65±159.38

444.13±254.06

0.0004606764

正常对照组

20

1428.18±1192.61

1039.60±785.64

1115.72±680.48

0.0013949759

2.其他类型肠梗阻与正常对照组20例其他类型肠梗阻组（阑尾炎术后肠梗阻12例、美克尔憩室表2：其他类型肠梗阻和正常对照组的M/Z位于2694.2、3520.2的统计资料

组别

n

2694.2(Mean±SD)

3520.2(Mean±SD)

p

其他类型肠梗阻

20

855.57±77.86

752.03±123.21

0.0562287977

正常对照组

20

925.19±176.24

 864.10±163.70

0.0593853167

术后肠梗阻3例、炎症性肠梗阻5例）和20例正常对照组血清标本检测的质谱数据经过对比发现，在M/Z位于2694.2和3520.2的2个血清蛋白质标志物处（表2），两组检测结果无显著性差异（P﹥0.05）。

讨    论

先天性巨结肠（HSCR）是由于肠壁肌层内缺少神经丛,使神经节细胞先天性缺如或减少。导致病变段肠管运动功能障碍而失去正常蠕动,而经常处于痉挛状态以致产生非器质性的狭窄,由于代偿使近端肠管异常扩大和肥厚而形成巨结肠。其病理改变为肠壁缺乏神经节细胞，发病率为1/5000，男女比例为4：1，主要原因是神经节细胞不能在肠壁内聚集定位，而这些神经节细胞不能定位和聚集主要与一些基因突变和肠道微环境变化有关[3]。目前其诊断主要依靠临床表现和辅助检查（包括：钡剂灌肠、直肠黏膜活检和直肠肛管测压）。部分新生儿由于出生时临床症状不典型而漏诊，文献报道新生儿期 20%钡剂灌肠结肠造影出现诊断错误[4]。这是因为新生儿期钡剂灌肠结肠造影时 ,痉挛段、移行段及扩张段分界不清 ,即此期的HSCRＸ线表现不典型。钡剂灌肠时由于清洁肠道准备、肛管内注入气泡等不当操作而出现“假性巨结肠”；钡剂稀释不当出现水中毒，严重时危及患儿生命；若检查前合并小肠结肠炎患儿容易导致肠穿孔继而造成钡剂性腹膜炎等严重并发症。直肠黏膜活检为创伤性检查，活检范围广泛则创伤较大，活检范围局限则漏诊机率增加，尤其对于短段及超短段型病人；同时行粘膜吸取组织化学检查尚存在出血、穿孔等危险 ,且病理技术要求高,阳性率为83%[5]。直肠肛管测压对新生儿HSCR的诊断符合率为64.3%~71.43% [6]，由于操作不当同时容易出现假阳性而误诊。而对于节段型无神经节细胞症亦称“跳跃性”HSCR是一种罕见的特殊类型，用上述理论无法解释[7]。至今为止，尚未发现对HD诊断特异性强的血清生物学标记物。因此，寻找理想的血清生物学标记物，探索临床症状及钡剂灌肠不典型、短段型、超短段型以及“跳跃型”HSCR的早期筛查及诊断新途径成为亟待解决的问题。

SELDI-TOF-MS技术是2002年开发的新型蛋白组学技术，具有快速、灵敏、高通量等特点[8]，在卵巢癌[9]、前列腺癌[10]、肺癌[11]、肝癌[12]、甲状腺癌[13]、肾母细胞瘤[14]、神经母细胞瘤[15]等的标记物筛选和早期诊断研究方面已经取得重大突破。本实验应用SELDI-TOF-MS技术结合生物信息学和支持向量机（SVM）方法，将蛋白质组学技术应用于HSCR血清蛋白质标记物检测，SVM是Vapnik等提出的一种分类技术，是在统计学理论基础上发展起来的新的机器学习方法，模式识别中小样本模型的推广性、模型选择、过拟和、 纬数灾难等问题在SVM中得到了很好的解决[16]。本实验数据处理中，通过离散小波分析去除噪音，用局部极值的方法找出样本质荷峰，以10%为最小阈值对质荷峰进行聚类。Wilcoxon秩和检验分析根据P值评价各个峰对区分两类样本的相对重要性。将差异显著的质荷峰随机组合输入SVM，筛选标记物，建立判别模型。用留一法交叉验证评估模型，即当一个样本作为测试，其余样本训练，反复测试直至结果稳定。因每次的测试集都是独立于用来训练的样本，完全做到盲法测试。经过以上多步骤、结合多种方法处理数据，确保了所建模型的推广性和预测的准确性。并发现了HSCR患儿血清中的可与正常小儿区分的特异性标记蛋白质，检测该蛋白质有利于HSCR的早期筛选及诊断。这些标记蛋白基于SVM组合建立血清蛋白质指纹图谱模型，以灵敏性100%，特异性100%成功地区分HSCR与正常小儿。预示该诊断模型在从健康婴幼儿筛选HSCR患儿具有良好的应用价值。筛出M/Z位于3221.7、5639.2和6884.2标志物3个，3标记物在先天性巨结肠术前组低表达，与正常对照组有显著性差异（P﹤0.01），其在先天性巨结肠术前组和正常对照组的表达强度分别为378.29±273.34、295.65±159.38、444.13±254.06和1428.18±1192.61、1039.60±785.64、1115.72±680.48。在HSCRE低表达，在正常对照组高表达，并且任一标志物就可以区分HSCR患儿和正常小儿,提示我们可应用SELDI-TOF-MS技术寻找用于HSCR早期筛选及诊断蛋白标记物。

应用SELDI-TOF-MS技术结合SVM建立先天性巨结肠血清蛋白质指纹图谱模型在国内外报道较少，本实验建立的诊断模型为先天性巨结肠症的早期筛选及诊断提供了一种新的技术平台，值得推广。