5'-单磷酸腺苷活化蛋白激酶活性降低对青春期小鼠乳腺发育的影响
2022年01月18日 【健康号】 汇聚专家共话临床     阅读 9690

乳腺是哺乳动物繁衍后代的重要器官,乳腺的发育直接影响其泌乳性能。乳腺发育的主要特点为其导管的延伸及导管上皮细胞的增殖。在青春期,乳腺导管上皮细胞的增殖是其增生的关键过程之一。



作者:天津市第五中心医院   王健

乳腺是哺乳动物繁衍后代的重要器官,乳腺的发育直接影响其泌乳性能。乳腺发育的主要特点为其导管的延伸及导管上皮细胞的增殖。在青春期,乳腺导管上皮细胞的增殖是其增生的关键过程之一。同时,当乳腺导管上皮细胞的增殖发生异常时,乳腺癌发生的风险则会提高。因此,通过寻找乳腺发育以及上皮细胞增殖的调控基因,进而通过干预其表达以更好地预防及降低乳腺癌的发病概率,对当前乳腺癌的临床研究起着重要的作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)为高度保守的应激性蛋白激酶中的一种,目前有关肿瘤细胞增殖转移等过程中AMPK所起的作用正在被人们关注[1,2,3],已有研究证明,当AMPK被激活后,乳腺癌细胞的增殖及转移则会受到抑制[4]。本研究以青春期正常小鼠乳腺为研究对象,探讨其上皮AMPK活性降低对导管上皮细胞增殖及终端末梢(TEB)发育的影响。

材料与方法

1.材料:

野生型(WT)小鼠的品系为BALB/c。AMPK显性负性突变转基因鼠(DN小鼠)由武汉伯远生物转基因技术公司协助获得合格证号:SCXK(沪)2016-0005。

2.方法:

选择乳腺上皮细胞特异表达的小鼠乳腺癌病毒(MMTV)启动子,其后放置外源α-flag用于转基因鼠的鉴定,其后连接D137处点突变AMPK α序列,编码序列后面加入BDH ploy A,用于进一步检测靶基因的成功表达。将AMPK显性负性突变基因通过显微注射技术注射到WT小鼠胚胎中,获得转基因小鼠(AMPK-DN)。采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)靶向检测BDH ploy A修饰片段的相对表达量,通过实时荧光定量PCR(qPCR)及α-flag的免疫组织化学针对质粒中导入的外源α-flag 片段进行检测,鉴定转基因小鼠。利用构建成功的转基因小鼠,通过杂交获得周龄为5至6周的青春期的小鼠,同样利用Real-time PCR靶向检测BDH ploy A修饰片段的相对表达量,通过qPCR及α-flag的免疫组织化学针对质粒中导入的外源α-flag 片段进行检测,鉴定转基因小鼠杂交后代其转基因型稳定表达。分离获得WT和转基因小鼠各10只右侧腹部第四对的乳腺组织,并对其进行全组织染色。对WT和转基因小鼠右侧腹部第四对的乳腺组织先后用10%的福马林固定、乙醇脱水、蜡包埋,最终获得组织切片对增殖细胞核抗原(PCNA)进行免疫组织化学染色分析。

3.观察指标:

采用Imagescope软件测量WT和转DN小鼠乳腺组织的以下指标:(1)导管覆盖面积:在脂肪垫中,整个导管结构所覆盖的面积;(2)导管初始长度:乳腺导管从起始点到终端末梢的距离,终端末梢不能超过淋巴结;(3)每毫米导管分支数:长度最长的3条导管上的分值数量与对应的导管长度的比值;(4)导管侵袭长度百分数:淋巴结中心与延伸最远的导管之间的平行距离及淋巴结中心与脂肪垫最顶端的距离之间的比值;(5)TEB平均数量:在相同周龄小鼠中,乳腺样本中TEB数量的平均值;(6)TEB平均最大面积:5个最大的TEB的面积平均值。分别选用3只WT和转基因型小鼠的乳腺组织切片,对PCNA进行免疫组织化学分析,若细胞核显示为黄色或棕黄色,则判定为阳性。随机挑选高倍镜视野下的10个成熟导管,统计G1、S、G2、M 4个上皮细胞分裂周期中的阳性细胞数,并计算其与腺体上皮细胞总数目的比值。

4.统计学方法:

应用SPSS 22.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,采用独立样本t检验,计数资料以百分比表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.AMPK乳腺特异性突变小鼠的鉴定:

利用构建成功的AMPK乳腺特异性突变小鼠杂交获得雌性小鼠,Real-time PCR靶向检测DN组小鼠BDH ploy A修饰片段的相对表达量增高,qPCR及免疫组织化学发现DN组小鼠外源α-flag 片段出现表达,而DN组小鼠AMPK磷酸化活性下降。

2.小鼠乳腺上皮AMPK活性降低对青春期小鼠TEBs发育的影响:

5~6周青春期时,与WT组比较,DN小鼠乳腺组织导管终端TEB增多,TEB面积增大,乳腺导管延伸,DN小鼠导管初始长度、导管侵袭长度百分数、导管覆盖面积与WT小鼠之间差异无统计学意义(P>0.05)。每毫米导管分支数、TEB平均数量、TEB平均最大面积均显著高于WT小鼠(t2.406、2.671、4.451,P<0.05),见1

1

5、6周青春期WT和DN小鼠乳腺组织导管及TEB相关数据的比较分析

3.小鼠乳腺上皮AMPK活性降低对青春期小鼠导管上皮细胞增殖的影响:

WT小鼠比较,第5~6周DN小鼠乳腺上皮细胞PCNA阳性细胞占比明显增高(5周:65.32±3.87比86.47±4.67,6周:63.47±3.45比85.37±4.35)(t11.027、20.208,P<0.05)。

讨论

增殖细胞核抗原(PCNA)作为一种核蛋白,真核细胞在进行细胞分裂时其在G1~M时期调节细胞有丝分裂[5]。G1时期时PCNA的表达量开始增加,当到S期时则达到最大值,随后在G2和M时期表达量逐渐降低[6]。PCNA目前还被应用于观察癌细胞的增殖情况[7,8]。本研究结果显示,转基因小鼠乳腺上皮细胞中PCNA阳性反应的细胞数量比例明显高于WT,说明与WT小鼠比较,转基因小鼠中乳腺上皮细胞分裂活动增多。

以往研究结果显示单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)与糖尿病等代谢类疾病有关,当人体患有代谢类疾病后,AMPK活性则会降低,通过药物刺激其产生后,代谢则会恢复正常。近期研究结果显示AMPK与肿瘤细胞的生长代谢有关,当AMPK被激活后,哺乳动物雷帕霉素靶向基因(mTOR)信号级联通路受到抑制,细胞分裂停止在细胞分裂周期G1期[9],同时,肿瘤细胞的代谢也会受到影响,最终肿瘤细胞的分裂及转移受到抑制[4]。有研究证实可以通过AMPK来治疗癌细胞的增殖[10]。雌激素是乳腺导管上皮细胞增殖的关键性启动因子[11]。有研究证实,正常人乳腺细胞中的AMPK表达量明显高于乳腺癌患者,在乳腺癌细胞中,当AMPK被激活时,雌激素能通过其来抑制癌细胞的糖代谢,进而抑制癌细胞的稳定性[12]。本研究结果显示,当AMPK表达量降低时,乳腺上皮细胞的分裂活动明显增加。这提示AMPK对乳腺上皮细胞的增殖具有调节作用,可能与上皮细胞的快速增殖有一定联系,因此我们推测AMPK可作为治疗乳腺癌的新靶点。本研究结果显示在小鼠青春期过程中,转基因小鼠终端末梢(TEB)结构的体积的增大速度要明显快于WT,说明AMPK活性降低后,能促进青春期小鼠TEBs的形成及上皮细胞的增殖,一定程度上表明AMPK的激活与导管的发育有关,可能也是青春期导管上皮细胞增殖多而妊娠期增殖少的原因。

本研究结果表明,在青春期,当小鼠的乳腺上皮AMPK活性降低后,能在一定程度上促进小鼠乳腺的发育。


参考文献

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