7省活产婴儿脐血547份，用ELISA法测定PIVKA-Ò浓度。对7省活产婴儿19 751人整群随机抽样分为婴儿干预组(VitK12 mg 10次，口服)和对照组(不使用VitK1)，哺乳母亲21 368人，整群随机抽样为母亲干预组(VitK110 mg 10次，口服)和对照组(不使用VitK1)。所有观察对象检测婴儿至满6个月。观察期间干预组及对照组的全部出血病例，VKDB，及其死亡和残疾病例全部以专门表格登记。

结果

       (1)城市足月婴儿脐带血protein induced by Vitamin K absence(PIVKA-Ò)阳性率3218%(85/259)，农村6518%(96/146)，城乡足月婴儿脐带血PIVKA-Ò阳性率差异有显著意义(V 2=411 0，P<01 001)。

       (2)婴儿VitK1干预组10 418例，4例发生出血，其中2例为Vitamin K deficiency bleeding(VKDB)，无死亡，无残疾，无1例晚发性VKDB病例。对照组9 333人，52例发生出血，其中30例VKDB(21例晚发性VKDB)，15例死亡，3例残疾，其中9例死亡，3例残疾由于VKD。

       (3)乳母VitK1干预组10 518例，8例发生出血，2例死亡，无残疾及晚发性VKD病例，2例死亡者排除VKD。对照组10 850例，50例婴儿发生出血，其中VKDB(晚发性9例)。14例死亡，5例残疾，其中4例死亡，3例残疾由于VKD引起。

       (4)小样本采集血测定PIVKA-Ò及VitK1浓度。婴儿干预组脐血、1个月及2个月血浆PIVKA-Ò阳性率分别为701 0%、010%、010%，对照组为7612%、281 6%、1413%。乳母干预组脐血、1个月婴儿血浆PIVKA-Ò阳性率分别为501 0%、1510%，对照组6617%、3313%。乳母干预组初乳、1个月及2个月乳汁VitK1平均浓度分别为01 65 Lg/ml、01 63 Lg/ml、0145 Lg/ml，对照组0128 Lg/ml、0118 Lg/ml、0115 Lg/ml。干预组与对照组乳汁VitK1浓度差异有显著意义。

结论

       (1)中国婴儿脐血PIVKA-Ò检测表明存在约40%的亚临床VitK缺乏;(2)婴儿及乳母口服VitK干预取得了显著效果。

       1997~2000年首都儿科研究所与七省妇幼保健机构合作开展婴儿维生素K缺乏(VKD)的研究。现将婴儿VKD及干预研究的主要结果报告如下。

对象和方法

       1. VKD血清流行病学调查选用VKD诱发蛋白Ò(protein induced by Vitamin K absence PIVKA-Ò)作为判断婴儿VKD的指标，对象为协作地区未使用维生素K的婴儿脐带血及少数母乳喂养健康婴儿1个月、2个月龄时的静脉血019 ml，加入含011 M枸橼酸钠的试管内，摇匀，以3 000转离心10 min，取血浆保存在-25 e以下冰箱中待检。

       2. 群体干预研究11抽样：干预工作在山东、湖南、甘肃、湖北、广东、河南、广西七省21个市县进行。干预地区农村以村(城市以地段)为基本单位，按乡行政村(或地段)自然排序编为单双号，单号为试验地区，双号为对照地区。抽样地区活产婴儿均为观察对象。婴儿VitK1干预10 418人，对照组9 333人;乳母VitK1干预10 518人，对照组10 850人。

       3. 方法：群体干预包括婴儿口服10次VitK，乳母口服10次VitK两种方法。(1)婴儿10次口服:试验组:出生后婴儿口服VitK 2 mg，以后每10天1次，每次2 mg，服至满3个月共10次。对照组:婴儿不服用VitK1。(2)乳母10次口服:试验组:分娩后母亲口服VitK1 10 mg，有母乳的母亲随后每10天1次共服10次。对照组:母亲及婴儿均不服用VitK1。婴儿及乳母VitK1口服，由干预村村医生或接生员负责实施登记，乡卫生院、县妇幼保健院参加

投服及监督指导。

       4. 观察内容：所有对象按统一设计的观察表观察6个月。试验组利用每10天VitK1投服时了解观察对象服用药物反应、喂养、出血及死亡、残疾情况。对照组利用新生儿访视、查体及预防接种询问婴儿喂养、出血及死亡、残疾情况、满6个月对所有家长进行走访调查并结案。所有出血病例是否为VKDB病例，由协作组专家按诊断标准[1]认真讨论予以诊断。

       5. 实验室检测：对一个县婴儿及乳母口服VitK干预组及对照组部分对象分别在出生时采集脐血，1个月龄及2个月龄时采集静脉血及母乳。检测血浆中的PIVKA-Ò浓度及母乳中的维生素K1含量。

       (1)PIVKA-Ò测定：本研究检测PIVKA-Ò采用单克隆抗体酶联免疫法(ELISA)，使用法国生产的PIVKA-Ò试剂盒(Diagnostica Stago)，所有试剂均由试剂盒提供。操作步骤均按试剂盒说明书进行。全部标本均在首都儿科研究所统一进行。其操作步骤如下：分别将200 Ll缓释液和50 Ll血加入96孔微量培养板中，室温放置1 h，用洗涤液连续洗涤5次。º每孔即刻加入200 Ll抗体酶结合物溶液，室温放置1 h，用洗涤液连续洗涤5次。»每孔即刻加入200 Ll A P-尿素-过氧化物溶液，室温放置5 min，加入50 Ll 3 M硫酸中止反应。¼室温放置10 min后，在波长492 nm处用Emax酶标仪测定A值，并在PIVKA-Ò标准曲线查出所测样品PIVKA-Ò含量。

       ½PIVKA-Ò标准曲线绘制：试剂盒提供的PIVKA-Ò标准品以蒸馏水稀释成2 ng/ml、50 ng/ml、120 ng/ml、200 ng/ml 4种浓度，每一标准浓度均有2孔，测定A值。以标准品浓度作横坐标，2孔标准品的A均值为纵坐标，连接各浓度标准品的坐标点为PIVKA-Ò标准曲线。检测标本的A值在标准曲线上查出相应的PIVKA-Ò含量。

       PIVKA-Ò结果判断：\2 ng/ml为阳性。(2)VitK1检测(在首都医科大学检测中心暗室环境下进行):¹样品前处理:a1血清:取血清1~2 ml与离心试管中，加入2倍体积的乙醇摇匀，加入5 ml正己烷，涡旋提取10 min离心。移取正己烷相于另一试管中，加入甲醇水(9B1)溶液5 ml，振荡洗涤5 min，离心。移取4 ml的正己烷于离心管中氮气吹干，准确加入甲醇B乙酸乙酯(95B5v/v，每10 ml加入2滴浓磷酸酸化)100 Ll溶解待检。b1乳品:取奶样品3 ml加入2倍体积的乙醇摇匀，再加入5 ml正己烷涡旋提取2 min，离心。移取正己烷相于另一试管中，氮气吹至015 ml时，进入硅胶型固相萃取柱中，加入8 ml正己烷洗柱，用正己烷B乙酸乙酯(95B5v/v)溶液8 ml洗脱，洗脱液氮气吹干，后同血样。ºVitK检测:取前处理后的样品于55 e水浴中预热，在不断摇动和预热条件下，分5~6次加入总量100 Ll的硼氢化钠乙醇饱和溶液，还原VitK1，离心分离，取100 Ll上清液相在高压液相色谱仪进行检测，使用仪器为岛津LC-4A。色谱柱Dupont C18，A S 250@416 mm，C18保护柱。流动相B甲醇B水(92B8v/v)，每100 ml流动相中加二硫苏糖醇14 mg，流速1 ml/min。以RF-530荧光检测器在激发光波长320 nm，发射光波长430 nm处检测VitK含量。

结果

       一、婴儿PIVKA-Ò阳性率共检测脐带血547份，PIVKA-Ò\2 ng/ml 242

例，阳性率4412%。足月婴儿PIVKA-Ò阳性率，城市3218%，农村6518%，城乡差异显著(V2=41，P<01001)。早产婴儿PIVKA-Ò阳性率，城市4212%，农村4612%，城乡差异不明显(V 2=0113，P>015)。

       不论城市、农村、足月与早产PIVKA-Ò阳性率无显著差异(1)。一个县39例足月婴儿在出生、1个月及2个月龄时取脐血及静脉血PIVKA-Ò的观察结果，显示其变化，随月龄增长，PIVKA-Ò阳性率明显下降，但满2个月龄时PIVKA-Ò阳性率仍达1413%。

       二、VitK1口服干预效果无论婴儿口服还是母乳口服VitK1干预组，婴儿出血率均低于对照组，V 2分别为46192和2912，P<01001，其中由于(Vitamin K deficiency bleeding VKDB)引起的出血率，两组差异也有极显著意义，V 2分别为2718和1816，P<01001。

       婴儿口服实验组4例发生出血，其中2例为Vit K缺乏出血。无死亡、无残疾发生，对照组52例发生出血，死亡、残疾分别为15例与3例，其中由于VKDB导致者分别为9例与3例;乳母VitK1干预组其婴儿8例发生出血，2例死亡，无残疾及晚发性VKDB。2例死亡由肺炎所致。对照组50例婴儿发生出血，其中VKDB 22例(late Vitamin K deficiency bleeding LVKDB 9例)。14例死亡，5例残疾，其中4例死亡，3例残疾由于VKDB(表3)。

       表4显示婴儿口服对照组的52例出血者中颅内出血者为24例，居首位，占4612%，试验组则无一例颅内出血者;试验组的4例出血者中3例为消化道出血，1例为皮肤出血。乳母口服对照组的50例出血者颅内出血者为21例，占4210%，其中VKDB导致者15例，占7114%，而试验组仅1例，且非VKDB所致;试验组由VKDB所致者1例，为消化道出血。无论婴儿及乳母口服VitK1均能减少婴儿各部位出血，尤其能显著减少颅内出血(表4)。

       三、小样本实验室检测婴儿脐血、1个月及2个月龄时血浆PIVKA-Ò阳性率，VitK预防组分别为7010%、010%、010%;对照组为7612%、2816%、1413%。两组脐血(未服药)PIVKA-Ò阳性率差异无显著意义(V2 012，P>015)。1个月及2个月龄时预防组婴儿PIVKA-Ò均为阴性，而对照组仍部分婴儿阳性。

       乳母预防组初乳、1个月、2个月乳汁VitK1均值分别为0165 ng/ml、0163 ng/ml、0145 ng/ml，对照组分别为0128 ng/ml、0118 ng/ml、0115 ng/ml。两组初乳VitK1含量，差异无显著意义。但1个月及2个月龄乳汁VitK1浓度，差异有显著意义。

讨论

       20世纪80年代，国外用血清VitK检测和VKD诱导蛋白(Protein induced by Vitamin K absenceÒ缩写PIVKA-Ò)诊断VKD。这两种方法的特异性、敏感性均较高。PIVKA-Ò是非活化的凝血酶原前体蛋白。VitK的作用是羧化凝血因子Ò、×、Ù、Ú，使其产生凝血活性。VKD时，Ò、×、Ù、Ú凝血因子，不能羧化，不具有凝血活性，这种由于VKD导致体内存在无活性的凝血因子Ò、×、Ù、Ú因子称为VitK缺乏诱导蛋白。VKD时血中PIVKA-Ò升高。因此PIVKA-Ò升高作为VKD特异而敏感的指标。该指标既可判断人群VKD的情况，也可以评价VitK干预效果[2-5]。本研究PIVKA-Ò试剂盒系法国Diagnostica Stago生产的，采用单克隆抗体酶联免疫法，7省547例脐血PIVKA-Ò阳性率4412%，1个月龄及2个月龄时仍有3018%、1413%的阳性，此结果表明:(1)我国出生婴儿普遍存在VKD;(2)婴儿VKD在1个月龄、2个月龄仍存在;(3)7省VKDB发病率为214 j，其中未使用VitK者VKDB发病率为3173 j，但PIVKA-Ò阳性率40%以上，表明存在大量亚临床VitK缺乏婴儿，这些亚临床VitK缺乏婴儿，在某些因素的影响下(如感染、腹泻等)有随时发生出血，甚至颅内出血的可能，因此我们认为应对婴儿普遍进行VitK干预。结合全国协作组VKD流行病学资料，VKDB 9714%在3个月内婴儿，VitK干预应持续到满3个月，由于VitK3、VitK4在新生儿服用后可加重黄疸及核黄疸发生率的增加，人群干预应使用VitK1或VitK2。

       1961年美国儿科学会营养委员会，提出新生儿出生后肌注VitK1 015~1 mg预防新生儿出血症建议后，婴儿VitK1预防和治疗VKDB在世界许多国家有了广泛的应用。总的趋势是由应用1次演变为多次;由肌注改为口服。文献报道4种方法:(1)出生后新生儿肌注VitK1 1 mg或口服2 mg，简单有效，但对晚发性VKDB效果有限;(2)母乳喂养儿每日服用25 Lg，至3个月;(3)出生后口服VitK1 2 mg，1周及1个月时5 mg，共3次;(4)出生时口服VitK1 1或2 mg，以后每周1次至3个月。以上预防方法，以每周1次服用方法最为满意的效果，丹麦163 000名婴儿接受每周1次VitK1 1 mg口服干预，结果未发生一例迟发性VKDB[6]。而且这种服用方法不会发生VitK的蓄积中毒[7]。

       根据国外预防婴儿VKDB的经验及服用VitK后药物血流动力学改变，血清VitK可维持5~10 d[8]。我们将药物的服用间隔由7 d，变为10 d。考虑到婴儿服用药物不如成人方便，我们又观察了乳母口服VitK1，10 mg@10次的效果。VKDB 90%以上发生在母乳喂养婴儿是因为母乳中VitK1的含量明显低于牛乳[9，10]，且母乳中抗体能抑制婴儿肠道正常菌丛产生VitK2。有实验表明[11-14]，乳母每天服用VitK1 20 mg，7天后母乳中VitK1含量仍稍高于服用前的水平，且母乳喂养的婴儿血中的VitK1水平也增加，PIVKA-Ò阳性率下降。因此，我们同时开展婴儿口服2 mg@10次及乳母口服10 mg@10次的群体干预，其结果显示，不论婴儿口服10次，还是乳母口服10次VitK1都能明显的减少婴儿出血病例，都未发生晚发性VKDB，未发生VKDB引起的死亡和残疾。口服10次VitK只需几元药费，便能有效降低新生儿及婴儿出血发生率及其导致的死亡和残疾。考虑到我国新生婴儿存在VKD的普遍性，在婴儿及乳母中大力推广口服VitK是十分重要和必要的。考虑到乳母服用比婴儿更为方便，我们更倾向于乳母服用，既保留母乳喂养的优点，又克服母乳中VitK的不足。