2020年7月22日，第五轮长征疑难肿瘤MTB（Molecular Tumor board，分子肿瘤专家委员会）诊疗会在上海长征医院如期举行。MTB它是一种多学科协作的模式，主要目的是从分子层面讨论肿瘤诊疗问题。既往MD Anderson Cancer Center、Mayo Clinic以及Freiburg University都有对MTB指导泛癌种的治疗做过报道，然而每个肿瘤类别，都有其独特的特征，唯有考虑其各异的特征进行分析，才能更好地使患者从MTB中获益。本次会议由上海长征医院承办，由肿瘤科臧远胜主任团队领衔发起，此外还邀请了病理科祝峙主任团队以及生信和分子生物学团队共同参与。三大团队就临床真实病例，从临床诊疗、病理分型和基因变异等维度进行多学科的深入讨论，为疑难肿瘤患者提供最佳的精准诊疗方案。

  接下来就由不同学科的专家带我们一起看看，如何基于科学理论和前沿进展为广大疑难肿瘤患者赢得更多的生存时间。

案例一：多线治疗均无效，NGS检测FGFR2融合，为患者赢得一线生机！ 患者基本情况及治疗过程：
       患者王某，女，70岁。2018年07月至外院行上腹部MRI示“肝占位”，考虑为“炎性病灶”，随访观察；2019年03月患者食欲明显减退，行MRCP示：肝左叶占位，肝门淋巴结肿大；行上腹部MRI示：肝左叶异常信号影，胆管细胞癌可能，转移瘤待排；2019年03月13日行“1.肝左外叶切除术；2.左内叶可疑结节剜除术；3.肝门肿大淋巴结清扫术”术后病理：1.“肝左外叶” 切除标本：胆管细胞癌，中低分化，MVI=M1，卫星灶（+）；肿瘤紧贴肝包膜，但未突破，手术切缘未见肿瘤累犯；2. “肝左叶IV段结节”示胆管细胞癌，中低分化；3.“肝门淋巴结1”（0/1）、“肝门淋巴结2”（0/1）均未见癌转移；免疫组化结果：CK(+)，CK18(+)，CK19(+)，CEA(-)，Ki67(80%阳性)，P53(+)，AFP(+)，Hep-1(-)，CD34(-)，GPC3(-);2019年04月24日胸腹CT提示：双肺多发小结节，考虑转移灶可能，肝内、肝门及腹膜后淋巴结多发转移；
2019年04月-06月行3周期GP方案化疗，第3周期化疗后患者自觉顶骨包块较前增大；2019年06月17日复查胸腹部CT提示：双肺多发小结节，较前增多增大；肝内、肝门及腹膜后淋巴结多发转移，肝内部分病灶较前增大，头颅MRI提示颅骨见类圆形软组织肿块影，考虑恶性可能，综合疗效评价PD；2019年07月-08月行2周期DP方案化疗，2周期后复查CT提示双肺小结节病灶较前增多增大、肝脏病灶较前增大，疗效评价PD；2019年09月29日安罗替尼治疗，1月后完善影像学检测，疗效评估SD(增大)；2019年11月-12月安罗替尼联合特瑞普利治疗。
最终诊断：胆管恶性肿瘤 pT2bN0M1 （肝内、肝门及腹膜后淋巴结、肺、颅骨）IV期

2019年08月取穿刺组织和血液分别进行520基因panel检测，变异汇总如下：

讨论问题：

1. FGFR2融合及靶向治疗

2. CDKN2A H83Y变异及治疗

 生信团队分析：
       1.FGFR2融合及靶向治疗FGFR家族在肿瘤细胞的增殖、分化、存活、迁移和血管生成等多个生物学过程中发挥重要作用，其融合、重排、易位和基因扩增与肿瘤的发生密切相关。文献报道，FGFR2融合或重排在肝内胆管癌中占10~16%，目前FGFR2已成为胆道系统肿瘤中的最具潜力的靶点之一。
本例患者检出FGFR2-WAC融合（F17:W13），该融合包含FGFR2的完整激酶结构域，且在胆管癌患者中曾被报道，被认为在本例患者的肿瘤形成过程中发挥着关键驱动作用。基于FIGHT-202研究中，pemigatinib在FGFR2融合患者中的优异表现， FDA已批准pemigatinib用于FGFR2融合或重排、不可切除的经治局部晚期或转移性胆管癌，因此，该药也成为FDA批准的首个用于胆管癌的靶向药物。此外，2018年ESMO大会报道，infigratinib (BGJ398) 用于FGFR2融合的晚期经治胆管癌患者的ORR达26.9%，mPFS和mOS分别6.8m和12.5m。

       延伸讨论：基因融合即两个或多个基因的编码区冲更新排列组合，共同置于一套开放阅读框中，融合既可以发生在DNA水平上，也可以发生在RNA水平上。多数情况下，融合基因可以导致序列异常、某些基因表达失调及蛋白功能异常，从而导致或促进肿瘤的发生。目前，融合基因的检测方法包括传统的荧光原位杂交（FISH）、PCR扩增技术（RT-PCR）、免疫组化（IHC）以及NGS等，公认的融合检测金标准为FISH和IHC，但各种技术在价格、检测范围、实验通量、灵敏性和特异性等方面各有优劣，共同助力肿瘤患者的基因融合检测和用药指导。

       2.CDKN2A变异及治疗

       CDKN2A基因是一种抑癌基因，在胆管癌中的变异频率约10~22%，其中点突变约占2~5%。H83Y变异位于CDKN2A基因的2号外显子，位于所编码蛋白的ANK3结构域。细胞实验表明，H83Y变异影响蛋白的诱导细胞G1停滞的功能，使Cdkn2a蛋白功能减弱，因此该变异为功能丧失性变异。文献报道，对于CDKN2A基因缺失或变异的胆道系统肿瘤患者而言，palbociclib单药治疗后的mPFS和mOS仅7.3周和11.1周，提示此类胆道系统肿瘤患者从palbociclib单药治疗中的获益有限。
       总的来说，本患者胆管癌，FGFR2融合是其驱动突变，也是可以用于指导患者用药的重要变异，本患者后续可考虑pemigatinib或infigratinib进行治疗。另外，palbociclib单药用于CDKN2A突变的胆道肿瘤疗效不佳，且CDKN2A变异对免疫治疗疗效的影响未知，值得深入探究。

 病理团队分析：

       1.首先，我们尚不明确患者肿瘤的确切大小，由于胆管癌肿瘤的大小与分期有关，肿瘤越小分期越早。本患者是T2期，预计肿瘤超过3cm；从免疫组化来看，CK、CK18和CK19常用于胆管上皮细胞和肝细胞的鉴别比较：CK是广谱的上皮来源细胞的指标；CK18在肝细胞和胆管细胞中均有表达，但在肝细胞中表达更多；CK19往往是胆管上皮特异性的标志，肝外胆管癌和肝内胆管癌的CK19表达均为阳性，而在肝细胞中很少会出现阳性表达。Hep-1和GPC3是肝细胞癌免疫组化的标记物，本患者这两个指标均为阴性；CD34标记血管外皮细胞，正常的肝细胞CD34为阴性，当细胞逐渐癌变，由于异常胶原物质的沉积，肝血窦会毛细血管化，CD34的表达由阴转阳，因此CD34是鉴别肝细胞癌与肝细胞增生的一个重要指标。本患者CD34阴性，因此排除肝细胞癌的可能；Ki67指数很高，为80%，因此综合各个指标，本患者倾向于分化较差的胆管细胞癌。
       2.其次，关于微血管侵犯（MVI），根据MVI的数量和分布，将MVI分为3个等级：M0，无MVI；M1（低风险），邻近肝组织距离肿瘤1 cm以内≤5个MVI；M2（高风险），邻近肝组织距离肿瘤1 cm以内>5个MVI，或MVI在距离肿瘤1 cm以外的肝组织中。本患者MVI为M1级，提示该肿瘤侵袭性较强，但由于肿瘤大小和血液AFP水平未知，因此病理检测上的辅助应用价值并不是很高。

 临床团队分析：
       1.胆管细胞癌是一个预后极差的肿瘤病种，对于肝内胆管癌，优选方案包括GP、GA；对于肝外胆管癌、胆囊癌以及年龄较大的患者，SOX方案也是一种选择。在常规治疗无效后，这例患者在一线GP、二线DP、三线安罗替尼联合PD-1治疗后，疾病进展，这时候就需要创新治疗。
       2.如生信团队所言，FGFR2融合在胆管癌的发生和治疗中的意义都是重大的。此前，我们也对靶向FGFR2靶点的药物疗效进行过相关研究，发现安罗替尼的抑制作用最强。但遗憾的是，本例患者接受安罗替尼治疗后疗效不尽如人意，可能是由于安罗替尼对于FGFR扩增的患者疗效更佳，而非FGFR融合。而且，针对FGFR2融合的药物Pemigatinib治疗FGFR2融合胆管癌患者的ORR为35%，DCR高达82%，这对胆管癌而言，是一个非常好的结果。目前，国内也可以对接到该药的相关临床研究，将更好地造福患者，这也是我们开展MTB的初衷！

案例二：沙漠中的绿洲：NGS解锁罕见肿瘤 患者基本情况：

       患者薛某，女，88岁；2019年04月09日因“阴道不规则流血半月”入院，B超示：子宫肌层回声不均匀，后壁见低回声37*18*33mm, 宫腔分离3mm；2019年04月12日行静脉麻醉下宫腔镜检查书+诊刮术；
 病理诊断：
       （宫腔）恶性苗勒氏管混合瘤。免疫组化：CK(上皮+), EMA(上皮+), P53(上皮间叶+), CA125(上皮间叶+)，ER(上皮+)，PR(上皮+)，CD10(间叶+)，WT1(少数上皮+)，CK7(上皮+)，SMA(间叶+)，CyclinD1(部分上皮+)，Desmin(间叶+)；2019年04月30日病理显示子宫内膜癌肉瘤，癌成分为浆液性癌及内膜样癌，肉瘤成分可见横纹肌肉瘤成分，免疫组化：Desmin(+), SMA(局灶+),  H-caldesmon(-), CD10(-),  MyoD1(+), Myogenin(+), ER(散在+)，P53(突变)，S-100(-);2020年06月胸部CT示双肺多发转移伴淋巴结转移；最终确诊：恶性苗勒氏管混合瘤
       2020年07月08日送检基因检测，结果如下：
       2020.07.21送检FISH检测，结果如下：

讨论问题：

1. 恶性苗勒氏管混合瘤

2. GOPC-ROS1融合及治疗

生信团队分析：
       1.恶性苗勒管混合瘤恶性苗勒管混合瘤（malignant mixed Müllerian tumor），也称恶性混合性中胚叶瘤（malignant mixed mesodermal tumor, MMMT）、恶性中胚叶混合瘤、恶性中肾旁管混合瘤、或癌肉瘤（carcinosarcoma），是一种病发于子宫、卵巢、输卵管和其他组织的恶性肿瘤，该混合瘤中均包含上皮组织和结缔组织。这种疾病较为罕见，占所有子宫肿瘤的2-5%，发病年龄为平均66岁。依次好发于子宫、卵巢、输卵管及阴道。该病很少发生于生殖道以外的部位。此类型肿瘤患者通常预后极差，5年生存率约33~39%。
本患者的组织和血液中均检测到FBXW7 R465H变异和TP53 R273C变异，与NCCN指南中恶性苗勒管混合瘤相关的分子发现相吻合。
从分子层面，恶性苗勒管混合瘤可分为4种亚型，分别为：POLE型、MSI型、CNH型和CNL型，不同亚型的分子突变谱、发病年龄以及预后各不相同；从组织病理学角度，恶性苗勒氏管混合瘤的癌成分主要有内膜样癌、浆液性癌、透明细胞癌、未分化癌等，肉瘤成分以子宫内膜间质肉瘤、横纹肌肉瘤、软骨肉瘤为主。本患者的癌成分为浆液性癌及内膜样癌，肉瘤成分可见横纹肌肉瘤成分，十分罕见。
       2.GOPC-ROS1融合本患者ctDNA检测发现GOPC-ROS1融合，而组织中未见该变异，取组织切片进行FISH检测，证实患者的组织切片中ROS1融合阴性，从而证实NGS检测的可靠性。
ROS1基因编码的是受体酪氨酸激酶超家族成员，对细胞生长和生存起着重要作用，ROS1常见的变异形式为融合，其融合伴侣以CD74居多，约占40~45%。本患者所检出的GOPC-ROS1融合曾在非小细胞肺癌、黑色素瘤、肝血管肉瘤、儿童高级别胶质瘤中被报道过。通过文献检索发现，一例携带EGFR exon19del 和T790M变异的NSCLC患者，奥希替尼治疗进展后出现获得性耐药变异——GOPC-ROS1(G8-R35)融合，采用奥希替尼联合克唑替尼治疗后，患者症状明显缓解。另有一例携带GOPC-ROS1(G4-R36)融合的肢端黑色素瘤患者，经恩曲替尼治疗3个月后肿瘤缩小38%，用药11个月后，肿瘤退缩55%，且耐受性良好。
       综上，本患者为恶性苗勒氏管混合瘤，又称为癌肉瘤，病理亚型较为罕见，值得持续关注。另外，在本患者的ctDNA检测中，除了与组织相同的变异外，还发现低丰度的GOPC-ROS1基因融合，充分说明对于晚期患者而言，血检结果能更全面地反映患者的变异水平。同样需要注意的是，根据现有信息，很难判断患者的肺部病灶是原发，亦或是恶性苗勒管混合瘤转移所致。因此，在患者身体条件允许的情况下，可考虑针对ROS1融合采取相应的靶向治疗。

 病理团队分析：
       1.B超可见肿瘤位于肌层，大小约3~4cm，两次病理与诊断病例基本相符合。所谓的苗勒氏管混合肿瘤并非良性，它既有癌的成分又有肉瘤成分，所以免疫组化检测结果可以看出，CK、EMA等上皮细胞来源的指标表达呈阳性；同时，间叶细胞来源的marker如CD10、SMA、Desmin等也为阳性，因此提示本患者既有上皮细胞来源的癌成分，也有间叶细胞来源的瘤成分。
       2.上皮组织中同时存在ER和PR的表达，说明存在子宫内膜腺体的分化，全子宫切除术后明确为子宫内膜癌肉瘤，其中癌的成分有浆液性癌、内膜样癌，均是由子宫内膜腺体癌演变而来；肉瘤成分为横纹肌肉瘤，免疫组化可以看到MyoDl和myogenin的表达。因此，本患者为子宫内膜癌肉瘤，又称为恶性苗勒氏管混合瘤，恶性程度很高，分化很差。
 

临床团队分析：
       1.该病例为一例典型病例，可以看出，这类肿瘤患者对于化疗并不是特别敏感，其次，这类肿瘤的生物学行为非常差，未来还是要继续关注这类患者。
       2.该例患者一线未接受过抗肿瘤治疗，且年龄较大，不在常规化疗的年龄范围之内，所以想通过基因检测寻求是否有靶向治疗的机会。从基因检测结果来看，有两个基因是值得我们去关注的。第一个基因是ROS1融合突变，对于这个患者，可以使用ROS1抑制剂如克唑替尼进行治疗，但是具体疗效如何有两个问题值得思考：ROS1是来源于上皮组织还是同时来源于上皮组织和间叶组织，这个问题暂不确定。因此，在癌肉瘤中检测到ROS1融合，有效率可能会更高。第二个是KRAS G12D，尽管目前针对KRAS的靶向药物研发困难，但是学术界一直对于RAS突变的难治性肿瘤特别关注。一款靶向KRAS的新型抗癌药BGB-283针对KRAS突变的子宫内膜癌，DCR为100%。因此，KRAS G12D也是值得考虑的靶点之一。
       3.针对KRAS突变患者，新疗法TIL的一项研究已经在新英格兰杂志上公布。对入组患者的新鲜组织样本进行基因检测，一例患者检测出为KRAS G12D突变，培养特异性肿瘤进入淋巴细胞，筛选出具有特异性靶向的T细胞以后回输免疫治疗，达到了很好的效果。这一新型疗法在RAS突变领域具有重要的意义！部分同意生信团队的建议，该基因突变频率很高，靶向药物可及性及可行性更高的话，当然优先选择靶向药物治疗；如不可行或疗效不佳，也可以考虑采用TILs细胞疗法治疗。

案例三：二代NTRK药物一击歼灭恩曲替尼耐药位点NTRK3 G623R/E

（应篇幅限制，已删减）

总结
       臧教授表示，MTB不是某一个两个医生的表演，而是团队智慧的结晶，需要各位专家学者的通力合作。今天的三个病例都有其特别之处，通过这三例难治性病例的诊疗经过以及NGS报告的MTB讨论，充分诠释了MTB的临床实践意义与作用，再次证明了MTB在肿瘤精准治疗中不可忽视的重要位置。通过MTB讨论打破专业间的壁垒，实现分子生物学信息和临床信息的融汇贯通，共同制定出适合患者的个体化治疗方案，让更多无药可治的疑难肿瘤患者可以有机会通过长征MTB团队的精准性方案制定，赢得一线生机！

       转载自《找药宝典》