体外受精周期取卵日卵泡液中代谢物质分析

王怀秀1.2 郭兴萍2.3 袁彩霞1 马斌国1北京家圆医院生殖中心王怀秀

【摘要】目的：对辅助生育周期取卵日卵泡液中离子及能量代谢物质进行检测及分析。方法：对17例体外受精周期的患者进行长方案垂体下调及卵巢刺激，取卵日对直径大于17mm的卵泡优先进行穿刺，将第一管颜色清亮的卵泡液在捡卵后离心，留上清，对其中钠、钾、钙、镁、氯、铁、锌、磷、丙酮酸、葡萄糖、氨基酸及游离脂肪酸进行检测。结果：卵泡液中钠、钙、镁、铁、锌、磷离子浓度及葡萄糖均显著低于血清正常值，丙酮酸浓度高于血清正常值。在氨基酸检测中，卵泡液中鸟氨酸、半胱氨酸浓度低于检测下限，显著低于血清正常值；天冬酰胺、组氨酸、精氨酸及酪氨酸浓度低于血清正常值下限；还检测到了以往文献报道只存在于脑组织中的γ氨基丁酸。在10例检测卵泡液游离脂肪酸的患者中，3例游离脂肪酸浓度高于血清正常值上限，该3例患者在胚胎移植后均未妊娠；7例游离脂肪酸浓度在血清值正常范围内，其中1例未进行胚胎移植，1例胚胎移植后未妊娠，5例胚胎移植后妊娠。结论：与血清正常值相比，卵泡液中多种离子、多种氨基酸及葡萄糖浓度显

著降低，该差异可能源自于血液成分透过卵泡-血液屏障时的选择性或/及卵泡代谢的特殊性。卵泡液中游离脂肪酸浓度过高对妊娠结局有不利影响，有可能作为妊娠的预测指标。此

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作者单位：1太原030012  山西省人民医院生殖医学科 2太原 030006 山西省出生缺陷与细胞再生重点实验室 3太原030006 山西省人口计生委科研所

基金项目：山西省科技厅基础研究平台基金（2014091035）

通信作者：王怀秀 

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外，从卵泡液中首次检测到高浓度γ氨基丁酸，其生理意义尚需进一步研究。

关键词：卵泡液，氨基酸，游离脂肪酸，葡萄糖，丙酮酸，γ氨基丁酸

The analysis of metabolites in follicular fluid of in vitro fertilization cycle on the day  of oocyte retrieval

Huaixiu Wang1、2 Xingping Guo2、3 Caixia Yuan1

(1Shanxi Provincial People’s Hospital, Taiyuan 030012, P.R.China 2 Shanxi Provincial Key Laboratory of Birth Defects and Cell Regeneration 3 Shanxi Provincial Research Institute of Population and Family Planning)

Abstract: Objective: To detect and analyse the metabolites in the follicular fluid of in vitro fertilization (IVF) cycle on the day of oocyte pick-up. Methods: In 17 infertile females, pituitary down regulation with long protocol and controlled ovarian stimulation were administered. On the day of oocyte retrieval , the follicles >17mm in diameter were aspirated at first, and the transparent follicular fluid in first tube was centrifuged after oocytes were picked-up. Na+ ,K+, Ca2+,Mg2+,Cl-, Fe2+、3+,P3+,Zn2+,pyruvate acid, glucose, amino acid and free fatty acid (FFA)  in supernatant were tested. Results: Compared with serum, the concentrations of Na+,Ca2+,Mg2+, Fe2+、3+,P3+,Zn2+and glucose were significantly lower and pyruvate acid was well above the upper limit, respectively. In amino acids, the concentrations of ornithine and cysteine were undected; asparagine, histidine. anginine and tyrosine  were all under the corresponding lower limit of serum. In addition, γaminobutyric acid  existing only in nervous system as litereture reported  was detected in follicular fluid in the study. In the samples

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of 10 patients, FFA was above the upper limit of normal serum level in 3 who failed to get pregnant after embryo transfer (ET); and was within the normal range of serum value in 7 among whom, 1 has not  accepted  ET yet, 1 did not become and 5 became pregnant after ET. Conclusion: Compared with serum, the concentrations of glucose, several kinds of ions and amino acids were lower, the difference might originates from the selective filtratrion of blood constituents across the  follicle-blood barrier and the characteristic metabolism in follicle. Higher FFA in follicular fluid may be detrimental to the outcome of IVF cycle and might be used as a prognostic marker. Theγaminobutyric acid was detected in the study for the first time and it might play a role physiologically in follicular development.

Key words: follicular fluid, amino acid, glucose, free fatty acid, pyruvate acid, γaminobutyric acid

卵母细胞在卵泡内要经历减数分裂，形成女性体内唯一的单倍体细胞。卵泡内的这一特殊过程决定了其代谢方式可能具有某些特殊性。与体内其他绝大多数组织或器官不同，卵泡内没有血管，卵母细胞在整个发育过程中所需的营养均来自于卵泡液，所产生的代谢产物也排泄入卵泡液中。对于卵母细胞来说，卵泡液是赖以生存的微环境。因此，了解卵泡液的成分，对于认识卵泡代谢以及卵母细胞发育的机制具有重要意义。本研究中，我们对辅助生育周期卵泡液中多种离子、葡萄糖、丙酮酸、氨基酸及游离脂肪酸进行检测，并对以上成分与辅助生育周期的治疗结局进行分析。

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1标本与方法

1. 1标本来源：

2. 1.1研究对象：从2015年5月初至5月底，在17例患者辅助生育周期取卵日采集卵泡

液。所有女性患者均为原发不育，采取辅助生育技术的适应症为输卵管阻塞，年龄在23岁至37岁，体重指数16.3-24.8。所有女性患者卵巢储备在正常范围，男方精液基本正常。

1. 1.2临床方案：取卵前一周期，所有患者从月经周期第5天开始口服避孕药，共21天。

月经周期第21天开始，每日皮下注射促性腺激素释放激素激动剂达必佳0.1mg,共7日，然后达必佳减量为0.05mg，直至注射绒毛膜促性腺激素（hCG）日。注射达必佳第14天，对患者进行超声检查及性激素检测。所有患者子宫内膜厚度<5mm,双侧卵巢内卵泡直径<10mmm,血清卵泡刺激素（FSH）<5mIU/ml, 黄体生成素（LH）<5mIU/ml, 雌二醇（E2）<50pg/ml，达到垂体下调标准。即日起每日皮下注射基因重组卵泡刺激素（果纳芬）225IU进行卵巢刺激，3日后果纳芬剂量根据卵泡超声监测结果进行调整。当直径大于17mm卵泡数目大于3个时，停止注射卵泡刺激素，并于夜间肌肉注射hCG10000IU，36小时后取卵。

1. 1.3卵泡液采集：取卵时，对直径大于17mm的卵泡优先进行穿刺，将取得的第一管颜

色清亮的卵泡液传递到实验室。捡取卵子后，将卵泡液2000g离心10min，留取上清液，—80。C保存，待检测。

该课题经医院伦理委员会审查通过，并在充分知情的基础上获得患者知情同意书。

1. 2方法：

（1）离子检测：钠离子、钾离子与氯离子采用离子选择电极法；钙离子采用比色法；镁离子采用络合指示剂法；磷离子采用磷钼酸紫外法；铁离子采用亚铁嗪法；锌离子采用电杆耦合等离子体质谱法。（2）葡萄糖检测采用葡萄糖氧化酶法。（ 3）丙酮酸检测采用酶法。（4）

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游离脂肪酸检测采用ELISA法。5、氨基酸检测采用高效液相色谱法。

    统计学分析：对离子及葡萄糖检测结果应用SPSS20.0 软件进行t检验。将卵泡液游离脂肪酸按照是否高于血清正常值范围与胚胎移植后是否妊娠进行卡方检验。P<0.05，具有统计学意义

结果.

以上项目检查结果如下表所示。

表1 辅助生育周期卵泡液中离子及葡萄糖检测

病例 Na+(mmol/l)  K+（mmol/l） Ca2+（mmol/l）Mg2+（mmol/l） P3+（mmol/l） Cl—（mmol/l）  Fe2+（3+）（μmol/l） Zn++（μmol/l）  葡萄糖（mmol/l）

1      136.00        4.20          2.01         0.95          0.93         104.00       7.50          9.64           3.48

2      132.00        3.76          2.00         0.80          1.10         100.00      11.80          9.64           3.57

3      135.00        4.17          1.94         0.73          1.32         102.00       7.10          9.64           4.08

7      131.00        3.84          1.81         0.67          1.07         100.00      13.00          9.79           2.92

9      133.00        3.93          1.83         0.62          0.87          99.00      14.60         10.55           4.06

11     130.00        3.92          1.90         0.72          1.22          96.00      13.60          9.64           2.45

13     133.00        4.10          1.99         0.72          1.32         102.00       9.60          8.87           2.98

15     135.00        3.98          1.98         0.85          1.13         106.00       4.50          8.87           3.37

16     133.00        3.71          1.86         0.87          0.97         101.00      10.60          9.18           2.48

17     137.00        4.01          2.07         0.94          1.10         105.00      11.50         10.09           3.32

X+S    133.50+2.22   3.96+0.16      1.94+0.09    0.79+0.11     1.10+0.15    101.50+2.99   10.38+3.21     9.59+0.52       3.27+0.57 

血清   135-145       3.5-5.5        2.2-2.7       0.8-1.2        0.97-1.61      96-108     10.7-27        10.7-17.7       3.9-6.1 

P    <0.01>0.05         <0.01        <0.01         <0.01>0.05       <0.01          <0.01          <0.01

从上表可以看出，除K+、CL—外，卵泡内其他离子及葡萄糖的浓度均低于血清。

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表2 辅助生育周期卵泡液中游离脂肪酸检测值

病例    游离脂肪酸测定值（μmol/l）

1         1736.47

10         703.07

15         638.03

13         731.42

16       13602.11

17         533.84

7          551.56

3          451.45

2          473.36

14         902.74

X+S        2032.41+4082.41

血清       300.00-900.00

由于病例1、14及16三例患者尤其是病例16卵泡液游离脂肪酸水平显著高于血清值正常范围，在胚胎移植后均未妊娠；病例3体外受精后将胚胎全胚冷冻，尚未进行胚胎移植；其他6例卵泡液游离脂肪酸在血清值范围之内的患者，除病例15外均获得妊娠。将卵泡液游离脂肪酸按照是否高于血清正常值范围与胚胎移植后是否妊娠进行卡方检验，卡方值5.625，p=0.018。

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表3 辅助生育周期卵泡液中氨基酸检测值（mg/l）

病例 天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 谷氨酰胺 甘氨酸 苏氨酸组氨酸 丙氨酸 精氨酸 酪氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 色氨酸 γ氨基丁酸 苯丙氨酸 异亮氨酸 鸟氨酸 亮氨酸 赖氨酸 脯氨酸 半胱氨酸

1         2.8      16.2    7.1      9.0    112.0     11.8    10.4    7.5    48.5  、9.5    7.10    16.0   3.2     5.1     1.4       7.6        4.0      <0.5   7.4    13.6   17.3    <0.5

7        <0.5      28.6   <0.5      3.6    49.9      10.5    13.8    9.2    43.1    9.7    6.5     19.3   1.9     7.8     1.2       6.5        4.4      <0.5   8.7    14.3   25.1    <0.5

15        3.0      14.1   7.6      13.1    98.9      13.4    16.7    8.4    45.4   10.1    8.0     19.8   3.2     7.9     1.3       7.4        5.9      <0.5   8.9    12.2   17.9    <0.5

血清      <0.8  2.1-28.3   9.3-18.5   8.7-20.6  87.1-131.0  9.8-24.4  9.5-24.7  9.3-19.2  16.0-47.0 10.8-26.0  8.5-17.4  17.8-37.7 3.0-6.6  7.6-16.1          7.4-14.5      5.8-13.8   4.2-12.2  12.9-23.6 15.5-42.1 23.0-32.3  3.2-8.6

正常值

由于例数太少，不能对检测数据进行统计学分析。但上表的数据显示，卵泡液中鸟氨酸及半胱氨酸明显低于血清正常值。值得注意的是，在卵泡液中检测到正常情况下仅存在于神经组织的γ氨基丁酸。

表4辅助生育周期卵泡液中丙酮酸检测值（μmol/l）

病例    丙酮酸检测值

4            317

5            328

6            287

12           324

X+S          314.00+18.57

血清正常值    30.00-100.00

由于例数太少，不能对检测数据进行统计学处理。但从表中数据可以看出，所有4例患者卵泡液中丙酮酸浓度均显著高于血清正常值。

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3讨论

由于卵泡与血管之间有一道屏障，卵泡液中的成分虽然源头上来自卵泡周围血管，但经过了卵泡—血液屏障的选择，卵母细胞及颗粒细胞产生的物质也部分进入卵泡液，这就决定了卵泡液与血浆以及一般组织液成分的不同。其实，卵泡液起着一个储物仓库的作用。其中的物质有的是代谢底物，有的是代谢产物，还有许多种类的蛋白质。本研究仅就人辅助生育周期取卵日卵泡液中电解质及葡萄糖、丙酮酸、游离脂肪酸、氨基酸等能量代谢物质水平进行探讨。

检测结果显示，卵泡液内Na+ 、Ca2+、 Mg2+、 P3+、 Fe2+、3+、 Zn2+等离子浓度显著低于血清值。这一现象可能是血液—卵泡屏障的选择的结果，也可能是卵泡代谢特殊性所致。

在本研究中，卵泡液葡萄糖浓度显著低于血清正常值。与其他组织相似，葡萄糖是卵泡的主要能量来源。但是在卵泡的不同阶段，其代谢方式有所差异。一般认为，原始生殖细胞及卵原细胞的能量代谢主要是厌氧方式和糖酵解，通过这种代谢方式，可以避免发生活性氧所致的损害【1】。到始基卵泡阶段，消耗的丙酮酸超出葡萄糖2倍以上，提示在这一阶段，卵泡在糖酵解的同时还存在线粒体内的氧化代谢，丙酮酸是其主要的代谢底物【2】。但是对

始基卵泡中的卵子代谢进行研究，仅仅发现了丙酮酸氧化的证据，没有发现葡萄糖氧化为CO2的过程【3】。基于以上研究结果，似乎颗粒细胞通过葡萄糖酵解产生丙酮酸，卵子利用丙酮酸进行三羧酸循环。也就是说，颗粒细胞为卵母细胞提供代谢底物。该代谢方式可能从始基卵泡一直延续到成熟卵泡。在卵泡中，葡萄糖除参与能量代谢外，还通过磷酸戊糖通路产生还原性辅酶II和嘌呤核苷酸的前体，对卵母细胞-颗粒细胞复合物的成熟发挥重要作用；通过氨基己糖生物合成通路，参与蛋白糖化以及透明质酸合成以完成卵丘扩张。可能正是由于卵泡内上述途径对葡萄糖的利用，导致成熟卵泡液中葡萄糖浓度低于血清水平。

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氨基酸是蛋白质、核苷酸、谷胱甘肽、透明质酸以及诸如一氧化氮等信号分子合成的底物。谷氨酰胺以及甘氨酸等氨基酸还可以通过代谢产生能量。此外，氨基酸还可以调节pH、渗透压、络合重金属离子、提供甲基等【4】。生长卵子以RNA及蛋白质的合成活跃为显著特征。例如，小鼠卵子RNA量以及蛋白质合成分别增加300倍及38倍【5】。因此，在卵泡发育中，氨基酸发挥着非常重要的作用。

在所有研究过的动物的生殖道中，谷氨酰胺、甘氨酸以及丙氨酸浓度都比较高【6】。本研究中，谷氨酰胺与丙氨酸浓度最高，与文献报道相近。在人体，谷氨酰胺约占游离氨基酸总量的60%。本研究中谷氨酰胺占卵泡液中氨基酸总量的比例也与整体的数据相似。谷氨酰胺有产生碱基的能力，可对卵泡液酸化起缓冲作用。另外，还可形成谷胱甘肽，参与抗氧化作用。卵泡是一个相对封闭的的环境，与血液循环存在屏障，不能及时充分利用血液中pH缓冲对及抗氧化机制。而谷氨酰胺以上作用有助于维持卵泡微环境酸碱度的稳定及对抗过氧化对卵子的损伤。我们在一项对卵泡液蛋白组学研究中发现，在卵泡液中进行的诸多生物学过程中，针对过氧化等应激反应有75种，数量之多居所有生物学过程之首（未发表）。从这

里，可以看出谷氨酰胺的重要性，同时可以理解卵泡液中谷氨酰胺高浓度的生理意义。

本研究中，鸟氨酸及半胱氨酸明显低于血清正常值。鸟氨酸主要参与尿酸循环，对于体内氨态氮的排除有重要作用。半胱氨酸可对多种毒性物质起解毒作用。排卵前卵泡体积较大，卵泡液达几毫升，其中代谢产物的排出较一般组织液困难得多。在此情况下，卵泡液中毒性代谢物质的转化、解毒就成为一个重要问题。卵泡液中鸟氨酸和半胱氨酸浓度降低可能是由于血液—卵泡屏障选择性过滤所致，也可能是鸟氨酸与半胱氨酸分别参与尿酸循环及解毒反应被消耗所致。

丙氨酸可协助葡萄糖代谢，为卵泡提供能量，参与蛋白质及核肽的合成，还可通过谷氨

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酸脱氢酶进行氨解毒。Hemmings 等对牛经体外成熟形成MII卵子的氨基酸进行定量分析，发现培养液中谷氨酰胺、精氨酸及天冬酰胺消耗最多，同时释放出丙氨酸及甘氨酸【7】。 在本研究中，卵泡液中天冬酰胺、精氨酸低于血清正常值低限而丙氨酸处于血清正常值的高限。不知甘氨酸浓度增加是否如Hemmings等发现的那样，是由于消耗天冬酰胺及精氨酸的结果。由于Hemmings等研究的对象是牛卵子体外培养液，本研究的对象是人体内卵泡液，不能直接用前者的发现解释后者。此外，本研究中卵泡液中组氨酸及酪氨酸浓度也显著低于血清值，目前我们未找到相关的文献对此进行解释。

需要特别提出的是，在卵泡液中检测到了γ氨基丁酸。根据文献资料，γ氨基丁酸几乎只存在于神经组织中，脑组织中的含量约为0.1-0.6mg g-1，其生理活性主要为（1）镇静、抗焦虑；（2）降低血压；（3）抑制谷氨酸的脱羧反应，降低氨浓度；（4）提高葡萄糖代谢时葡萄糖磷酸酯酶活性，增加乙酰胆碱生成。显然，上述资料不能直接用于卵泡液中γ氨基丁酸功能的解释。由于血液中几乎无γ氨基丁酸，其来源可能是由卵泡产生。如果扩大样本进行检测证实γ氨基丁酸确实以一定浓度存在于卵泡液中，则需要对其在卵泡发育中的作用进行深入研究。    

在卵子生长过程中脂质逐渐积累，其氧化能产生大量ATP分子（一个棕榈酸分子完全氧化可产生106个ATP分子）。如此高效率的功能使得脂肪酸成为能量代谢的重要物质。比如，猪和牛卵子在体外成熟过程中以及在牛卵子受精后三磷酸甘油酯浓度下降【8】。另外，牛卵子在体外成熟后脂肪酶活性增强【9】；在用绒毛膜促性腺激素促排卵后小鼠卵子—颗粒细胞复合物中ß氧化限速酶中的肉碱棕榈酰转移酶1B上调【10】。在小鼠，在卵子成熟培养过程中阻断ß氧化可抑制由环一磷酸腺苷激活的蛋白激酶介导的减数分裂的启动【11】。最近有学者报道，在小鼠和猪卵子体外成熟培养液中以及牛胚胎培养液中添加肉碱可提高培养效果【12】,

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其机理可能是肉碱具有抗细胞凋亡的作用以及对脂肪酸ß氧化的促进作用。综合以上文献，推测脂肪酸的ß氧化的加强可以提供大量能量，从而使葡萄糖转用于非产生ATP的通路，比如合成核酸、透明质酸、信号转导以及氧化还原反应的调控。

在本研究中，卵泡液游离脂肪酸高于血清正常值的3例患者均未怀孕，而卵泡液游离脂肪酸水平在血清正常值范围并进行胚胎移植的6例中5例获得妊娠。Jungheim 等曾报道，人卵泡液中升高的游离脂肪酸水平（>232μmol l-1）与卵子质量异常相关。但是，卵泡液游离脂肪酸浓度与血清游离脂肪酸浓度相关性较低（r=0.212）。虽然肥胖患者血清棕榈酸与亚油酸均高于非肥胖患者（分别为160μmol l-1vs140μmol l-1 ,p=0.03;140μmol l-1 vs 120μmol l-1, p=0.02）,但两类患者卵泡液以上两种脂肪酸浓度无明显差别【13】。本研究中部分患者卵泡液内游离脂肪酸浓度增高可能是卵泡内游离脂肪酸代谢方式与速率异常所致。

本研究对辅助生育周期卵泡液中的代谢物质进行了分析。我们意识到，本研究存在两点不足之处。一是检测标本偏少，尤其是氨基酸和丙酮酸，检测例数尚不满10例，这使研究结果的代表性受到影响。二是在辅助生育周期，由于促性腺激素及其他药物的应用，发育卵泡数目大量增加，雌二醇等性激素水平也显著升高。在这些因素的影响下，卵泡代谢可能与

自然周期卵泡的代谢有所差异。因此，本研究的结果不能代表自然周期卵泡的代谢。由于对卵泡液的代谢进行研究对认识卵泡发育机理具有重大意义，对改进卵泡培养方法具有重大价值，需要对自然周期及辅助生育技术卵巢刺激周期卵泡代谢进行大样本及深入研究。

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