Construction and identification of the recombinant plasmid expressing NT4-TAT-6X His -VHL βfusion peptide

  刘庆勇 陈 杰 杨伯平  张建军  李宗武  郭 锋  王司军  张士宝山东省千佛山医院泌尿外科刘庆勇

山东大学附属济南市中心医院 泌尿外科，济南250013

目的：VHL的β结构区104-123短肽，能够抑制肾癌生长和侵袭转移。为了使用该短肽作为肾癌基因治疗的微小目的基因（minigene），构建了包扩真核信号肽，标签肽和膜渗透肽的融合肽cDNA克隆。方法: 分别设计合成VHL的β结构区104-123短肽cDNA的正向和反向引物和编码TAT-6*His的正、反向引物,使用互为引物模板PCR方法，扩增获得具有Nae I/Eco721酶识别位点的TAT-6*His cDNA片段和具有Eco721/BamH I酶识别位点的VHLβ抑制肽cDNA片段，将两个片段分别克隆到pGEM-T easy 中，使用双脱氧终止法测序，使用DNAsis分析软件分析同数据库资料一致性和编码的氨基酸序列。  用Nae I和BamH I双酶切获取的TAT-6*His-VHLβcDNA片段插入到具有NT4信号肽的pBV220载体中，构建了pBV220-NT4-TAT-His-VHL β质粒。结果: 经DNA测序证实使用互为引物模板方法，我们成功的获得了编码TAT-6*His cDNA片段和编码VHL β抑制肽的cDNA片段，DNAsis分析软件分析证实核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒V220-NT4-TAT-His-VHL β酶切物理图谱证实我们已经将NT4-TAT-His-VHL β融合肽cDNA克隆到pBV220原核表达载体中。结论: 我们采用用互为引物模板PCR方法，成功扩增了编码TAT膜渗透肽和6His标签肽和VHL抑癌基因β结构域肾癌抑制肽的cDNA片段，使用分子生物学方法构建了具有NT4信号肽的TAT-His-VHL β融合肽cDNA克隆。为分泌表达具有膜渗透肽和标签肽和VHL β结构肾癌抑制肽融合基因治疗肾癌的奠定了基础。

[关键词] VHLβ结构域肾癌抑制肽; 融合肽，微基因，肾肿瘤。

基金项目：山东省自然科学基金资助项目（Y2006C04）