罗格列酮抑制体外大鼠肝星状细胞活化

郭晏同1,赵景明1,宋磊1,周迈2,焦岗军2,李涛3,冷希圣3

(1.北京大学第四临床医学院 北京积水潭医院 普外科,北京100035；2.北京民航总医院 普外科,北京 100022；3.北京大学人民医院 普外科,北京 100044)

摘要  目的 探讨罗格列酮（PPARg配体）对肝星状细胞(HSCs)作用的机制。方法 将原代HSCs随机分为3组：对照组；TGF-β1（5?g/L）组；TGF-β1加10?mol/L罗格列酮组。加药后48h用RT-PCR法检测细胞Ⅰ型前胶原的表达。用Western blot方法检测细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原的表达。免疫荧光化学标记，共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖。结果 TGF-β1明显促进HSCs的增殖，促进HSCs表达Ⅰ型胶原和α-SMA（P<0.01）；罗格列酮显著降低TGF-β1的作用（P<0.01）。各组细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7的表达无明显差异。结论 PPARg配体可以抑制TGF-β1对HSCs的活化作用。

关键词 肝星状细胞；PPARg；肝纤维化

中图分类号：R542.220.5 文献标识码: A

Rosiglitazone depressed activation of rat hepatic stellate cells in vitro

GUO Yan-tong1,ZHAO Jing-ming1,Song Lei1,ZHOU Mai2,JIAO Gang-jun2, LI Tao3,LENG Xi-sheng3

(1.Department of Surgery,Beijing Jishuitan Hospital,the Fourth Clinical College of Peking University,Beijing 100035,China;2. Department of Surgery,General Hospital of CAAC,Beijing 100010,China;3.Department of Surgery,People’s Hospital of Peking University,Beijing 100044,China)

Abstract  Objective To investigate the mechanism of effect of rosiglitazone (PPARg ligand) on rat hepatic stellate cells (HSCs) in vitro. Methods The primary cultured HSCs were randomly divided into three groups: the control group, TGF-β1（5?g/L）group, TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone group. Detecting the samples 48 hours after the HSCs were treated with TGF-β1（5ng/ml）and TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone respectively: The expression of type Ⅰ pro-collagen was detected by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The expressions of SMAD3、SMAD4、SMAD7、α-smooth muscle actin (α-SMA) and type Ⅰcollagen were measured by using Western blot assays. The expression of α-SMA was marked by immunofluorescence and observed under confocal microscope. The cell proliferation was determined with MTT colorimetric assay. Results TGF-β1 significantly increased the proliferation of HSCs and thus promoted HSCs to express type Ⅰcollagen and α-SMA（P<0.01）; these effects of TGF-β1 were suppressed by rosiglitazone（P<0.01）. The difference of expression of SMAD3、SMAD4、SMAD7 in each group was not statistically significant. Conclusion PPARg ligand can suppress the activation of TGF-β1 on HSCs.

Key words　Hepatic　stellate cells(HSCs); Peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARg); Hepatic fibrosis

基金项目：国家自然科学基金（30371387）

 迄今的研究资料表明[1]，肝星状细胞（hepatic　stellate cells，HSCs）在肝纤维化发生中起关键作用。肝脏遇到致病因子侵袭时，静息的HSCs被激活分化为肌成纤维样HSCs，分泌胶原和多种细胞因子，引起胶原沉积导致肝纤维化。此外，有关罗格列酮（peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARg）配体提高PPARg的表达并抑制HSCs的增殖及胶原合成，抑制α-SMA的表达，减少细胞分泌Ⅰ型胶原等作用也已得到了实验证实[2]，但对Ⅰ型前胶原启动子的序列分析后发现并不存在PPARg对靶基因进行直接调控所需要的PPRE序列[3]，但包含SBE（Smad-binding element）序列，也就是说，PPARg配体的作用机制可能与TGF-β1有关。近几年对HSC的研究表明[1]，HSC的活化受多种因素的调控，包括细胞及细胞外基质(ECM)成分、细胞因子和生长因子等，其中以TGF-β1的作用最为重要。TGF-β1[4]是最强的促胶原生成因子，其信号传导分子为Smads蛋白。这里选择具有代表性的Smad3、Smad4、Smad7进行检测。

1 材料与方法

1．1动物

使用饲养50周的SD大鼠（北京大学医学部实验动物中心），体重(450±56)g，分离培养原代HSCs，使用培养第3天的HSCs进行实验[5]。将HSCs随机分为3组：对照组；TGF-β1（5?g/L）组；TGF-β1加10?mol/L罗格列酮组。加药后作用48h。

1．2 试剂

PPARg配体选用罗格列酮(rosiglitazone)（Merck公司）。大鼠TGF-β1（ProTech公司）。兔抗PPARg多克隆抗体、兔抗TGF-β1单克隆抗体、标记FITC的抗小鼠荧光二抗（Santa Cruz公司）。兔抗I型胶原多克隆抗体（武汉博士德公司）。鼠抗α-SMA多克隆抗体（Oncogene Research公司）。标准胎牛血清、DMEM培养基（Promega公司）。6、24及96孔细胞培养板（Corning公司）。RNA的提取及RT-PCR用品： Trizol、Superscript Ⅱ反转录酶（Gibco公司）；Taq酶、Oligo(dT)、Rnasin及DNase I（Promega公司）；焦磷酸二乙酯(DEPC)（Sigma公司）；DEPC水：DEPC 1ml，加到1000ml三蒸水内，浓度为千分之一，室温过夜后，高压15min；核酸分子量参照物：100bp DNA梯度标准（北京鼎国公司）。Ⅰ型前胶原及内参照b－肌动蛋白（b-ACTIN）引物均由上海生工公司合成。Ⅰ型前胶原的上游引物：5’-CGATGGATTCCCGTTCGAGTAC-3’；下游引物：5’-GTCCACAACCCTGCTGTAGGTG-3’，扩展片断长246bp；b-ACTIN的上游引物：5’-TGGGACGATATGGAGAAGAT-3’；下游引物：5’-ATTGCCGATAGTGATGACCT-3’,扩增片断长522bp。PCR反应：Ⅰ型前胶原及内参照b-ACTIN引物加入反应体系中，反应条件：95℃ 5min；94℃ 20s,55℃ 30s,72℃ 40s,进行29个循环；后延伸72℃ 5min；同时设立阴性对照。半定量分析：PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳后摄像，图象分析测定灰度值。通过调整上样量将各组b-ACTIN灰度值调至基本一致时比较各组Ⅰ型前胶原的灰度值。

1．3 Western blot

各组细胞常规用RIPA进行裂解及蛋白提取，测蛋白浓度。30%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为50?g总蛋白。电泳后转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉封闭，然后依次进行一抗、二抗孵育，最后用ECL 化学发光试剂显影和X线胶片成像。图像分析系统（Kodak，EDAS290，U.S.A.）进行灰度测定分析。所得值代表各组样品的SMAD3、SMAD4、SMAD7、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达量。

1．4 免疫荧光化学标记，共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达

HSC种于薄的盖玻片上，处理48h后，取出盖玻片，用4%的多聚甲醛固定15min，PBS冲洗后，用山羊血清封闭，然后依次与抗α-SMA一抗抗体，标记FITC荧光素的二抗孵育，最后用共聚焦显微镜在相同激发光条件下，观察FITC绿色荧光在细胞中分布和各组细胞荧光强度的差异。用荧光定量分析软件进行分析，所得的吸光度值代表α-SMA的表达量。

1．5 MTT法检测细胞的增殖

将细胞接种到96孔板上。细胞在含体积分数为16%小牛血清的DMEM培养液中生长至对数生长期时换体积分数为1%小牛血清的DMEM培养基继续培养24h，使细胞生长停止。然后换体积分数为16%的小牛血清的培养液，每组设立6个复孔，分别加药后作用48h，用MTT法测定A570各孔吸光度值。

1．6 统计学分析

所有数据以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS13.0 for windows专业统计软件进行数据分析处理，两样本均数间比较用t检验。多个样本均数间的比较用方差分析，多个样本均数间的两两比较用 q 检验(Newman-Keuls法)。

2  结果

2．1  RT-PCR检测各组细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达

TGF-β1明显促进HSCs表达Ⅰ型前胶原，但TGF-β1的这种作用可以被罗格列酮所抑制(图1，表1)。

M：Marker；A：control group；B：TGF-β1（5?g/L）group；

C：TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone group.

图1A  Ⅰ型前胶原mRNA的表达

A：control group；B：TGF-β1（5?g/L）group；

C：TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone group.

图1B    Western blot检测SMAD3, SMAD4, SMAD7, α-SMA,Ⅰ型胶原蛋白的表达水平

Figure 1    TypeⅠpro-collagen mRNA level (A) and expression of SMAD3, SMAD4,SMAD7, α-SMA and type Ⅰcollagen by Western blot(B)

表1  Ⅰ型前胶原mRNA的表达及Western blot检测SMAD3, SMAD4, SMAD7, α-SMA,Ⅰ型胶原蛋白的表达水平

Table 1  TypeⅠpro-collagen mRNA level and expression of SMAD3, SMAD4, SMAD7,  α-SMA and type Ⅰcollagen by Western blot（x?±S,n=6）

 group                         A                             B                                  C

typeⅠpro-

collagen mRNA

                               0.6235±0.0082       1.6422±0.2267*       0.8265±0.1722

SMAD3                   17500±1722           15600±1810            16400±1682

SMAD4                   16900±1126           18100±2344            16900±1272

SMAD7                   17600±2023           15100±2242            20600±2679

α-SMA                    17900±1722           32600±4917**         11200±987.8

type Ⅰcollagen      22600±2263           31700±4876*          19200±2128

 A：control group；B：TGF-β1（5?g/L） group；C：TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone group. *P<0.05  and **P<0.01 compared with control group.

2．2  Western blot检测各组细胞Smad3、Smad4、Smad7、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达的变化

各组细胞SMAD3、SMAD4、SMAD7的表达无差异。TGF-β1组Ⅰ型胶原和α-SMA 的表达明显高于对照组（P<0.01）。罗格列酮可显著降低TGF-β1的作用（P<0.01），回降至对照组值(图1，表1)。

2．3  免疫荧光化学标记，共聚焦显微镜下观察α-SMA的表达

TGF-β1组α-SMA 的表达明显高于对照组（P<0.05），TGF-β1加10?mol/L罗格列酮组与对照组之间无差异（图2，表2）。

A                    B                    C

图2  免疫荧光化学方法检测α-SMA的表达

Figure 2  Expressions of α-SMA by immunofluorescence  ×200

 A：control group；B：TGF-β1（5?g/L） group；C：TGF-β1 with 10?mol/L          

          rosiglitazone group.

2．4  MTT法检测细胞的增殖

TGF-β1组的细胞增值活性明显高于对照组和罗格列酮组（P<0.01）（表2）。

表2  MTT法检测细胞增殖和免疫荧光化学检测α-SMA的表达

Table 2  Comparison of HSCs proliferation by MTT  and expressions of α-SMA by immunofluorescence（x?±S,n=6）

group        colorimetric value          a value

A               0.5621±0.1140                612±26.77

B               1.1366±0.2022**             1320±187.69*

C               0.6242±0.1093                879±72.79

 A：control group；B：TGF-β1（5?g/L） group；C：TGF-β1 with 10?mol/L rosiglitazone group. *P<0.05  and **P<0.01 compared with control group.

3  讨论

HSCs的活化受多种因素的调控[6]，目前认为TGF-β1的作用可能最为重要。TGF-β1能刺激HSCs表达多种细胞外基质成分，刺激HSCs表达金属蛋白酶组织抑制因子，抑制降解细胞外基质的金属蛋白酶的表达，抑制HSCs凋亡，诱导肝细胞凋亡、抑制肝细胞再生等多种功能[4]。HSCs通过自分泌和旁分泌作用表达TGF-β1，使TGF-β1呈正反馈性增加和ECM大量合成，加速肝纤维化的进程。TGF-β1的信号传导主要通过SMAD2、SMAD3、SMAD4等蛋白分子参与[4]。当Ⅰ型受体（TβR-Ⅰ）激活后，SMAD2和SMAD3通过与TβR-Ⅰ短暂结合而直接发生磷酸化，而SMAD4则被活化的TβR-Ⅰ间接激活。激活的SMAD2、SMAD3和SMAD4聚集成共同复合体或形成数个异源二聚体复合物。其后，SMAD4复合物转入核内与特异的DNA结合蛋白结合，直接使包含SBE序列的靶基因转录。SMAD6、SMAD7对 TGF－β1 信号传导通路有拮抗作用。

从实验中可以看到，TGF-β1对HSCs的活化作用是很明显的。PPARγ配体可以抑制TGF-β1对HSCs的活化作用，这可能是PPARγ配体对肝星状细胞活化调控的机制之一。以前的研究表明[2]，PPARg配体可以提高PPARg的转录活性，PPARg转录活性的提高可能抑制了TGF-β1诱导的TGF-β1的表达，阻断HSCs的TGF-β1自分泌环路，从而减少了TGF-β1诱导的胶原分泌和HSCs的增殖。但在我们的实验中，没有检测到TGF-β1的信号传导分子SMAD3、SMAD4的表达发生变化，也没有检测到起拮抗作用的SMAD7的表达变化。这些信号传导分子的表达量虽然没有受到影响，但它们的活性或者进入核内与DNA结合的过程是否受到PPARg转录活性提高的影响仍然需要进一步研究。

参考文献

[1] Reynaert H, Thompson MG, Thomas T, et al. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension[J].Gut, 2002;50(4):571-581.

[2] 郭晏同，冷希圣，李涛，等.过氧化物酶体增殖物活化的受体g特异配体罗格列酮对肝星状细胞生物学特性的影响[J].解剖学报，2005；36（2）：34－38.

[3] Kelly LJ ,Vicario PP ,Thompson GM,et al.Peroxisome proliferator activated receptors gamma and alpha mediate in vivo regulation of uncoupling protein (UCP21,UCP22,UCP23) gene expression[J]. Endocrinology，1998，139 :4920-4927.

[4] Knittel T，Mehde M，Kobold D，et al. Expreeion patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-alpha and TGF-beta1[J]. J Hepatol， 1999;30:48-60.

[5]  翁山耕，冷希圣，魏玉华, 等. 改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定[J]. 北京大学学报：医学版，2001；1(33): 83-86.

[6]  Gutiérrez-Ruiz MC, Gómez-Quiroz LE.Liver fibrosis: searching for cell model answers[J].Liver Int， 2007;27(4):434-439.